论文总字数：19133字

摘 要

为了将甜菊糖中含量较高且略带苦味的甜菊甙（Stevioside, St甙），催化成甜度高且味质最好的莱鲍迪甙A（Rebaudioside-A,RA甙）。从双酶偶联（蔗糖合成酶和糖基转移酶）的角度出发，以大肠杆菌为研究对象，通过对大肠杆菌发酵产酶的条件优化，获得酶活较高的粗酶提取物。在此基础上来催化St甙转化成RA甙.再通过改变底物St甙，粗酶的量，反应温度（T）及蔗糖的浓度等条件的优化，以期提高产物的转化率，进而能够提高RA甙的产量。通过以RA作为标准品的HPLC检测法，检测终产物的转化率。研究发现，合成RA甙的最佳优化体系为：温度(T）35℃，St甙浓度30mmol/L,蔗糖浓度100mmol/L，粗酶浓度9mg/mL，50mmol/L磷酸钾缓冲（pH=7.2）若干。最终转化率预计达到89%。

关键词：蔗糖合成酶(AtSUS1) 糖基转移酶(UGT76G1) 条件优化 莱鲍迪甙A

Process optimization of enzymatic synthesis for rebaudioside A

ABSTRACT

In order to catalytic synthesis of high sweetness rebaudioside A (RA),we use Stevioside with a lightly bitter flavor . From the perspective of conjugated double enzyme (sucrose synthase and glycosyltransferase),E.coli as the research object, by improving the different catalytic reaction conditions to obtain higher activity of the crude enzyme extract.On the basis of the study,we convert ST into RA.By improving the ST, the amount of the crude enzyme, PH and the reaction temperature (T) ,to improve the conversion rate of the product, to further improve the yield of RA.Finally we use HPLC to detect the conversion rate of the product.

According to the study,we know that the best optimized synthesis of RA should be :temperature 35℃;(ST) at a concentration of 30mmol/L; sucrose (Suc) at the concentration of 100mmol/L; the concentration of the crude enzyme is 9mg/mL ;50mmol/L potassium phosphate buffer (pH = 7.2) .The final conversion rate can reach more than 89%.

Key Words: Sucrose synthase; Glycosyl transferase; Condition optimization; Rebaudioside A

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 莱鲍迪甙A（RA甙）概述 1

1.1.1 甜菊糖（Steviol glycosides） 1

1.1.2 RA甙 2

1.1.3 RA甙的物化性质 2

1.2 RA甙的研究现状 2

1.2.1 树脂分离法 2

1.2.2 RA甙的制备-重结晶法 3

1.2.3 生物合成RA甙 3

1.3 RA甙的检测 3

1.3.1 高效液相色谱法（HPLC） 3

1.3.2 薄层色谱法(TLC) 4

1.3.3 毛细管电泳（GE） 4

1.3.4 液滴逆流分配层析（DCCC） 4

1.4 酶法催化生产RA甙 4

1.4.1 糖基转移酶 4

1.5 本论文研究目的及手段 5

第二章 莱鲍迪甙A的工艺优化 6

2.1 前言 6

2.2 实验材料和方法 6

2.2.1 实验仪器 6

2.2.2 实验菌株 8

2.2.3 工具酶，试剂盒和Marker 8

2.2.4实验试剂 8

2.2.5 培养基成分及流动相 9

2.3 实验方法 9

2.3.1前期准备 9

2.3.2菌的活化 9

2.3.3 提质粒实验操作步骤 9

2.3.4 凝胶电泳 10

2.3.5 转化 11

2.3.6发酵罐培养 11

2.3.7 制备粗酶 11

2.3.8 测定蛋白浓度 12

2.4 催化合成反应体系 12

2.4.1 研究最适反应温度（T） 12

2.4.2 研究粗酶添加量 12

2.4.3 研究底物蔗糖的添加量 12

2.4.4 研究底物ST甙的添加量 13

2.5 HPLC测定莱鲍迪甙A 13

2.5.1 标准曲线的测定 13

2.5.2 样品的制备 13

2.5.3 色谱条件 13

2.6 实验结果与讨论 13

2.6.1 质粒验证 13

2.6.2 粗酶的蛋白浓度 14

2.6.3 标准曲线 14

2.6.4 温度对反应体系的影响 15

2.6.5 粗酶变量对反应的影响 16

2.6.5 蔗糖浓度的改变 17

2.6.6 反应底物ST甙的影响 19

第三章 主要结论与前景展望 21

3.1 主要结论 21

3.2 展望 21

参考文献 22

致谢 24

第一章 文献综述

1.1 莱鲍迪甙A（RA甙）概述

1.1.1 甜菊糖（Steviol glycosides）

甜叶菊（Stevia rebaudiana）属多年生菊科草本植物，叶片中含有甜菊糖甙，在我国主要分布在江苏、安徽、黑龙江、甘肃等地区，湖南、江西、福建、云南等地也有种植。甜菊糖由30多种糖甙混和而成，且不同糖甙味质差异较大。甜菊糖总甙中的两种主要成分为St甙和 RA甙^[1,2]。甜菊糖被称为“世界第三蔗糖”^[3]。在甜叶菊植物组织中发现主要有：甜菊糖甙，RA甙，莱鲍迪甙C和杜尔可甙A^[4]。甜叶菊的培养时间，种类和收获时间对甜菊糖的组成有影响^[5]， St甙占甜叶菊叶片干重的5–10%， RA甙占甜叶菊叶片干重的2–4%^[6,7]。图1为甜菊甙分子结构式 。

图1 甜菊甙分子结构式

请支付后下载全文，论文总字数：19133字