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摘 要

(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶（S-NBHP）可以用于合成一种非天然药物抗充血性心力衰竭药卡莫瑞林、BTK抑制剂（ibrutinib）、天然物质异白刺啉淋胺(isonitramine)和小果白刺碱(sibirine)等药物前体，因此该化合物具有广泛的应用前景，挖掘具有催化合成S-NBHP能力的酶是目前研究的热点^[1]。

本研究使用来自于近平滑丝酵母中的羰基还原酶CprCR，并将其在大肠杆菌中重组表达，酶活测定显示其粗酶液对底物N-Boc-3-哌啶酮的酶活9.2U/mg蛋白。将表达CprCR的重组大肠杆菌全细胞用于催化N-Boc-3-哌啶酮合成S-NBHP，催化体系中添加了表达葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌细胞和辅底物葡萄糖用于辅酶再生，避免了额外添加辅酶NAD（H）。反应24h后，20g/L的底物被完全转化为S-NBHP，产物光学纯度e.e.值gt;99%，这表明其具有很高的活性和立体选择性。

不对称还原反应需要辅酶NADH的参与，双菌催化的模式可以实现辅酶的循环再生，但是两种酶分别在两种细胞内，降低了催化的效率。与全细胞催化体系相比，游离酶催化体系中的酶尽管更容易失活，但其由于没有细胞膜这道屏障，反应速率会得到提高。在单一水相的催化体系中，较高浓度的N-Boc-3-哌啶酮和S-NBHP均对酶有一定毒害作用。而使用有机-水双相催化的方式能够降低水相中的底物和产物浓度，减轻其对酶的毒害作用。因此，本文尝试使用双相的全细胞催化体系和游离酶体系，并对双相催化体系的有机相进行优化以提高催化效率。在33%体积分数的乙酸丁酯条件下，产率达到89.2%。使用粗酶代替全细胞用于不对称转化S-NBHP，在添加辅酶量0.1mmol/L的情况下，产率达94.8%，比全细胞体系高出7.5%。

关键词：(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶 羰基还原酶 辅酶再生 双相催化

Cloning, expression and catalytic synthesis of S-NBHP from Candida parapsilos

Abstract

S-NBHP can be used to synthesize a non natural drug anti charge bloody heart failure drug Kamo Ruilin, Btk inhibitors, natural substances different white Cilan drench amine and small fruit white thorn alkali drugs such as precursor, therefore the compound has broad application prospects, mining is the focus of current research is enzyme catalyzed synthesis of S-NBHP ability[1].

This study used from nearly smooth Candida carbonyl reductase cprcr and the in Escherichia coli recombinant expression, enzyme activity assay indicated that enzyme to substrate N-Boc-3-piperidone crude enzyme liquid live protein 9.2U/mg. Will express cprcr recombinant Escherichia coli cells for catalytic N-Boc-3- piperidone synthesis S-NBHP, catalytic system to add the expression of glucose dehydrogenase recombinant Escherichia coli cells and glucose as cosubstrate for coenzyme regeneration and avoid the extra added NAD (H). After the reaction of 20g/L, the substrate of 24h was completely transformed into S-NBHP, and the product was optically pure gt;99% E.E., which showed that it had a high activity and stereo selectivity.

The asymmetric reduction reaction requires the participation of coenzyme NADH, which can achieve the recycling of coenzyme, but the two enzymes in the two cell, reduce the catalytic efficiency. Compared with the whole cell catalytic system, the enzyme in the free enzyme catalytic system was more easily inactivated, but the reaction rate would be improved because of the lack of cell membrane barrier. In single phase catalytic system, high concentrations of N-Boc-3- and S-NBHP were piperidones have some toxic effects on the enzyme. And the use of organic water biphasic catalytic method can reduce the concentration of the substrate and the product in the aqueous phase, and reduce its toxic effect on the enzyme. Therefore, this article attempts to use the dual phase of the whole cell catalytic system and the free enzyme system, and the dual phase catalytic system to optimize the organic phase to improve the catalytic efficiency. Under the conditions of 33% volume fraction of butyl acetate, the yield reached 89.2%. The use of crude enzyme instead of whole cell for asymmetric conversion of S-NBHP, in the case of the addition of coenzyme 0.1mmol/L, the yield of 94.8%, 7.5% higher than the whole cell system.

keywords:S-NBHP; carbonyl reductase; cofactor regeneration; biphase catalysis

目 录

摘 要 Ⅰ

ABSTRACT Ⅲ

第一章 文献综述 1

1.1 手性药物及(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的性质、应用及市场前景 1

1.1.1 手性 1

1.1.2 手性药物 1

1.2 (S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的合成 2

1.2.1 化学制备S-NBHP究进展 2

1.2.2 生物制备S-NBHP研究进展 2

1.3 辅酶再生体系 3

第二章 羰基还原酶CprCR的克隆表达及功能鉴定 5

2.1 前言 5

2.2 材料和方法 5

2.2.1 实验材料 5

2.2.2 实验试剂 6

2.2.3 工具酶及试剂盒 7

2.2.4 菌株与质粒 8

2.2.5 培养基及培养方法 8

2.3 实验方法 9

2.3.1 近平滑假丝酵母基因组的提取 9

2.3.2 目的基因片段CprCR的克隆 9

2.3.3 重组质粒pET-28a-CprCR的构建及鉴定^[23] 10

2.3.4 目的蛋白CprCR的表达 11

2.3.5 目的蛋白CprCR的酶活测定 12

2.3.6 全细胞催化不对称还原N-Boc-3-哌啶酮 12

2.3.7 底物及产物的检测方法 13

式中S为(S)-N-Boc哌啶醇的浓度，R为(R)-N-Boc哌啶醇的浓度。 13

2.4 结果与讨论 13

2.4.1 近平滑假丝酵母基因组的提取 13

2.4.2 目的基因的PCR扩增 14

2.4.3 重组质粒的构建和PCR鉴定 15

2.4.4 CprCR的表达酶活力测定 15

2.4.5 双菌耦合催化不对称合成S-NBHP 16

2.5 本章小结 16

第三章 高效辅酶循环催化体系合成S-NBHP的研究 17

3.1 前言 17

3.2 实验材料与方法 17

3.2.1 实验仪器 17

3.2.2 实验试剂 17

3.2.3 菌株与质粒 17

3.2.4 工具酶 17

3.2.5 培养基与培养方法 18

3.3 实验方法 18

3.3.3 游离酶-全细胞催化体系催化N-Boc-3-哌啶酮 19

3.4 结果与讨论 19

3.4.1 底物浓度对催化的影响 19

3.4.2 有机-水双相催化体系 20

3.4.3 游离酶催化合成S-NBHP 20

3.5 本章小结 21

第四章 主要结论及展望 23

4.1 主要结论 23

4.2 展望 23

参考文献 25

致 谢 28

第一章 文献综述

1.1 手性药物及(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的性质、应用及市场前景

1.1.1 手性

手性是指一个物体与其镜像不重合的一种性质。在微观的分子层面上，手性的性质也得以体现：分子的手性通常是分子中的手性碳原子引起^[2]，即和一个碳原子相连的四个基团都互不相同。通常人们使用（RS）、（DL）、（±）这些符号对其进行区分和识别。

手性是自然界的一种基本属性，手性现象也广泛存在于生物系统中。构成生物体的最基本物质：核苷酸，单糖，氨基酸以及由这些基本物质构成的生物大分子：核酸，糖类，蛋白质都具有手性的特征，正是由于手性，才使它们具有多种生物活性，从而构成了复杂的生物体。近几十年来，手性化学研究在多个领域尤其是生物医药学科中发展迅速^[3]。

1.1.2 手性药物

手性药物是指药物化合物分子中引入了手性中心，形成了单一的光学异构体，具有光学活性^[4]。同样化学结构的药物分子，两种对映异构体在非生物体结构中仅仅只有旋光性的差别，其它理化性质几乎完全一致。而在生物体环境中，手性药物和体内生物大分子通过极其严格的手性配对来发挥药理作用，所以两种对映异构体所发挥的作用可能是截然不同的。随着研究的深入，药物中对映体具有的不同药理活性受到了广泛关注和越来越多的重视，许多国家开始对手性药物的开发作出相应的规定。2001 年，美国、日本的三位科学家因为对手性化合物研究领域的重大贡献，被授予了当年的诺贝尔化学奖^[5]。

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