论文总字数：18424字

摘 要

作为四碳二酸的琥珀酸一直是许多旨在开发更经济可行的发酵含糖天然材料的方法的研究项目的焦点。本文首先通过做一组产琥珀酸放线杆菌利用葡萄糖，乳糖，阿拉伯糖以及经不同方式处理得到的海藻水解液发酵生产琥珀酸，确定利用海藻水解液发酵生产琥珀酸的可行性以及海藻的最佳处理方式。接着通过控制变量法做了两组不同条件下影响产琥珀酸放线杆菌利用海藻生产琥珀酸产量的实验，确定了发酵的最适温度，最适pH，使产琥珀酸放线杆菌利用海藻生产琥珀酸的发酵条件得到优化。

关键词：产琥珀酸放线杆菌 海藻 发酵 琥珀酸

Actinobacillus succinogenes Produces Succinic Acid Using Seaweed

ABSTRACT

Succinic acid, a four-carbon diacid, has been the focus of many research projects aimed at developing more economically viable methods of fermenting sugar-contain- ing natural materials. In this paper, succinic acid was fermented by a group of Actinobacillus succinogenes using glucose, lactose, arabinose and seaweed hydrolysate processed in different ways to determine the feasibility of fermenting succinic acid production with seaweed hydrolysate and the best treatment of seaweed.Then,the effects of two different conditions on the production of succinic acid from Actinobacillus succinogenes using seaweeds were tested by the control variable method,the optimal temperature for fermentation, the optimum pH were determined. The fermentation conditions for the production of succinic acid from Actinobacillus succinogenes using seaweed were optimized.

Key Words:Actinobacillus Succinogenes;Seaweed;Fermentation;Succinic Acid

目 录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 绪论 1

1.1 前言 1

1.2 产琥珀酸放线杆菌和海藻 1

1.2.1 产琥珀酸放线杆菌 1

1.2.2 海藻 2

1.3 本论文的研究目的及内容 2

第二章 产琥珀酸放线杆菌利用海藻生产琥珀酸的可行性 3

2.1 海藻的处理 3

2.1.1 海藻的酸水解 3

2.1.2 海藻的碱水解 3

2.1.3 海藻的酶水解 3

2.2 海藻水解液中糖分分析 4

2.3 实验材料 4

2.3.1 菌种 4

2.3.2 碳源 4

2.3.3 培养基 4

2.4 实验方法 5

2.5 实验结果与讨论 5

2.5.1 发酵所得产物的分析 6

2.5.2 副产物形成和碳平衡 7

第三章 发酵条件优化 9

3.1 实验材料 9

3.1.1 菌种 9

3.1.2 培养基 9

3.2 实验方法 9

3.2.1 发酵温度对产琥珀酸放线杆菌130Z生产琥珀酸产量的影响 9

3.2.2 发酵pH对产琥珀酸放线杆菌130Z生产琥珀酸产量的影响 10

3.3 实验结果分析 11

第四章 结语与展望 12

参考文献 13

致 谢 16

第一章 绪论

前言

琥珀酸也称为琥珀酸或丁二酸，是一种常见的天然有机酸，可由三羧酸循环途径代谢或酮酸羧化支路产生，广泛地存在于人体、动植物和微生物中^[1]。琥珀酸也是很多微生物的天然主要发酵产物，如产琥珀酸厌氧螺菌^[14]，产琥珀酸放线杆菌^[15]和产琥珀酸曼氏杆菌^[16]等，通过基因工程（或突变），琥珀酸生产也可以通过其他宿主，例如大肠杆菌和酿酒酵母来实现^[2]。琥珀酸可以用于农业，食品加工和制药行业的许多化学品的前体，例如：作为表面活性剂，清洁剂，各种绿色溶剂，生物可降解聚合物^[2]和刺激动物和植物生长的一些成分^[7,8]等。琥珀酸发酵过程也会消耗二氧化碳，从而可能有助于减少二氧化碳排放。在过去的十年中，琥珀酸（SA）被认定为生物炼制平台化学制品的先驱。琥珀酸作为潜在的大规模生物质衍生化学品已经被确定到美国能源部的名单里（2004年）^[3]，并且在2010年更新时仍然在名单上^[4]。目前市场上的琥珀酸的生产方法主要分为化学合成法和生物发酵法，通过化学工艺合成成本高，也会对环境造成一定的污染，而通过微生物发酵获得琥珀酸是利用可生成琥珀酸的微生物将可再生的生物质能源进行发酵，不仅成本低得多，对环境也更友好。产琥珀酸放线杆菌能够利用的碳源范围广泛，很多种可再生的生物质资源都能被它发酵利用，而且产琥珀酸放线杆菌生产琥珀酸作为主要的发酵产物；海藻作为可再生的生物质资源含有丰富的糖类适合作为碳源，而且价廉易得，因此本文主要研究了产琥珀酸放线杆菌利用海藻生产琥珀酸的发酵条件优化方面的问题。

产琥珀酸放线杆菌和海藻

1.2.1 产琥珀酸放线杆菌

与其它可通过发酵生产琥珀酸的微生物相比，产琥珀酸放线杆菌表现出独特的生产琥珀酸的能力，能从广泛的碳源如阿拉伯糖，纤维二糖，果糖，半乳糖，葡萄糖，乳糖，麦芽糖，甘露醇，甘露糖，山梨糖醇，蔗糖，木糖或水杨苷等在厌氧条件下产生相对大量的琥珀酸^[17]。与大肠杆菌或产琥珀酸厌氧螺菌不同，产琥珀酸放线杆菌是一种中等嗜热菌，对高浓度的葡萄糖具有良好的耐受性，这对发酵是有益的。

1.2.2 海藻

琥珀酸目前主要通过将马来酸酐催化氢化成琥珀酸酐并随后进行水合或通过马来酸的直接催化氢化而由原油生产^[8]。然而石化原料生产琥珀酸价格昂贵，并造成严重的污染问题。人口增长和对能源和商品的相关需求再加上更严格的环境法规以及石化燃料燃烧引起的碳排放日益受到关注，这加剧了寻找可再生能源原料来替代或补充石化燃料来源的可能性^[9,10]。最近的分析表明，由可再生资源发酵生产琥珀酸和温室气体二氧化碳可能比使用石油基工艺生产更具成本效益^[11]。海藻作为一种生物质能源含有成分复杂的混合糖，其中包括葡萄糖，乳糖，蔗糖，果糖，半乳糖，阿拉伯糖等等，利用海藻作为碳源完全可以满足发酵过程中的培养基碳源需要，而且海藻的来源广阔，价格低廉十分适合工业生产的需要。使用海藻生产琥珀酸减少了利用有限的石油储量的需要，从而使生物炼油厂的潜在产品组合多样化^[12]。在生物炼制的概念范围内，可再生生物质原料的利用已经成功地用于一系列产品的发酵生产，包括乳酸，乙醇，聚羟基丁酸酯（PHB）和琥珀酸^[13]。

本论文的研究目的及内容

全球琥珀酸市场（1997年为15,000吨，年均增长率为6-10％/年）远低于同类竞争化学品马来酸酐（1997年为213,000吨，年均增长率为增长率为每年3.6％）。这一方面是由于化学过程将马来酸酐转化成琥珀酸的转化成本高，这限制了琥珀酸在广泛应用中的使用，另一方面，最近的分析表明，利用可再生生物质资源发酵生产琥珀酸可比石油基工艺更具成本效益。因此研究产琥珀酸放线杆菌利用海藻生产琥珀酸非常具有市场价值。本文主要通过实验研究了产琥珀酸放线杆菌利用海藻生产琥珀酸发酵条件优化方面的问题，致力于得到更有利于产琥珀酸放线杆菌利用海藻生产琥珀酸的条件，从而使琥珀酸生产量达到更高水平。

第二章 产琥珀酸放线杆菌利用海藻生产琥珀酸的可行性

2.1 海藻的处理

2.1.1 海藻的酸水解

酸水解通常分为浓酸（酸含量为30%-70%）水解和稀酸（酸含量lt;2%）水解。由于浓酸水解时还需要进行酸回收，同时延长了反应时间，以及具有腐蚀性和较高的危险性，因此稀酸水解是更常用更可取的方法，成本低，反应速率高，且可以高效水解木质纤维素获得糖类。近年来采用稀酸水解木质纤维素的报道很多，一般水解含纤维素生物质采用稀盐酸，稀硫酸以及稀磷酸，其中稀硫酸较多。在本实验中采用稀硫酸来水解海藻。

将海藻先用蒸馏水浸泡两小时左右，取出后放入烘箱中烘干，在烘干后的海藻中加入固液比为1：2的稀硫酸，静置24小时使海藻充分水解。24小时后取出，真空抽滤3次以去除其中的杂质得到海藻的水解液。向抽滤完成后得到的海藻水解液中逐渐加入CaCO₃，边加边调节海藻水解液的pH，直至将海藻水解液的pH调至7.0，调节好pH后将海藻水解液放入旋转蒸发器中蒸发浓缩得到海藻水解液1。

2.1.2 海藻的碱水解

将海藻先用蒸馏水浸泡2小时左右，取出后放入烘箱中烘干，在烘干后的海藻中加入固液比为1：2的2%的NaOH溶液，静置24小时使海藻充分水解。24小时后取出，真空抽滤3次以去除其中的杂质得到海藻的水解液。向抽滤完成后得到的海藻水解液中逐渐加入稀盐酸，边加边调节海藻水解液的pH，直至将海藻水解液的pH调至7.0，调节好pH后将海藻水解液放入旋转蒸发器中蒸发浓缩得到海藻水解液2。

2.1.3 海藻的酶水解

酶水解法是一种条件温和的水解方法，在本实验中使用纤维素酶水解海藻。将海藻先用蒸馏水浸泡2小时左右，取出后放入烘箱中烘干，烘干后取出继续向海藻中加入蒸馏水浸泡，并且溶液pH 调整至8.0，加入纤维素酶适量， 在60℃水浴中处理12小时，12小时后将得到海藻水解液通过真空抽滤3次以去除其中的杂质，蒸发浓缩得到海藻水解液3。

2.2 海藻水解液中糖分分析

通过高效液相色谱法（HPLC）确定海藻水解液1，2，3中的糖的种类，并且测量各种糖的浓度。 将海藻水解液（20 μl）以0.9ml/ min的流速注入柱（C18,250长度9 4.6 mm内径，9l m; StrodsII Peek）中，使用脱气和过滤的硫酸（0.01N）作为流动相^[8]。结果发现海藻水解液中含有葡萄糖，蔗糖，乳糖，半乳糖，果糖，阿拉伯糖等多种糖分。HPLC系统由等度溶剂泵（Waters 1515），恒温自动进样器（Waters 717 plus），柱温箱（Waters Column Heater Module），UV检测器（Waters 2487）和RI检测器（Waters 2410）组成。 在Aminex HPX87P（BIO-RAD，Hercules，CA，USA）柱上在85℃以0.6 ml/min流速的超纯水（Millipore，Billerica，MA，USA）作为流动相分析糖的浓度，发现海藻水解液中葡萄糖含量最多，浓度大约为90 g/L，蔗糖，乳糖，半乳糖，果糖，阿拉伯糖的含量都较少。

2.3 实验材料

2.3.1 菌种

产琥珀酸放线杆菌 （Actinobacillus succinogenes）130Z

2.3.2 碳源

将通过酸水解，碱水解，酶水解得到的海藻水解液1，海藻水解液2，海藻水解液3都加入纯水稀释3倍备用作为碳源备用，另外在配备浓度都为30 g/L的葡萄糖，乳糖，阿拉伯糖也作为碳源备用。

2.3.3 培养基

酵母粉：10.0 g/L；乙酸钠：1.36 g/L；NaCl：1.0 g/L；CaCl₂：0.2 g/L；MgCl₂·6H₂O：0.2 g/L；NaH₂PO₄·2H₂O：1.6 g/L； Na₂HPO₄·12H₂O：0.3 g/L；K₂HPO₄：3.0 g/L；玉米浆干粉：7.5 g/L；碱式碳酸镁（每个发酵瓶1.2 g）

2.4 实验方法

种子培养：在每个发酵瓶中加入1.2 g的碱式碳酸镁，碱式碳酸镁主要用于维持培养基的pH稳定，将在冰箱中低温保藏的产琥珀酸放线杆菌130Z的菌种取出，在超净台上操作，把菌种接种在种子培养基中，完成接种后，向种子培养基中充入 CO₂气体，盖好瓶盖后拿到摇床中37℃培养 20-28 h，当菌种达到对数生长期时，把发酵瓶从摇床中取出，把种子液转接到发酵培养基中。

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