论文总字数：17120字

摘 要

活性氧(Reactive oxygen species , ROS)是生物体内氧的单电子还原产物。在酵母细胞中，ROS的生成和清除系统处于一种动态平衡状态。当受到盐、重金属等外界的胁迫时，ROS的动态平衡将会被打破，进而导致ROS的过量累积。过多的ROS会引发酵母细胞氧化应激，最终会对细胞的脂质、蛋白质、DNA造成氧化损伤，诱发多种疾病。本课题主要研究ICT1基因缺失在酵母抗氧化防御系统中的影响,通过稀释点样、RT-PCR、TLC、HPLC等实验研究ICT1敲除菌在氧应激下生长缺陷的内在机制。

关键词：活性氧；酵母抗氧化防御系统；氧化损伤

Study on the Mechanism of ICT1 Gene in Yeast Antioxidant System

Abstract

Reactive oxygen species(ROS) are single electron reduction products of oxygen in living organisms.In yeast cells,ROS production and scavenging system is in a state of dynamic equilibrium.When subjected to external stress such as salt and heavy metal,the dynamic balance of ROS will be broken,which leads to excessive accumulation of ROS.Excessive ROS can cause oxidative stress in yeast cells,which will result in oxidative damage to lipids,proteins and DNA of cells,and induce various diseases.This topic mainly research that deletion of ict1 gene has an effect on the yeast antioxidant system.The intrinsic mechanism of ict1Δ strain was studied under oxidative stress through dilution spotting,RT-PCR,TLC,and HPLC experiments.

Key words：Reactive oxygen species；Yeast antioxidant system；Oxidative damage

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1 活性氧 1

1.1.1ROS的产生与类型 1

1.1.2ROS对生物大分子造成的氧化损伤 1

1.2 酵母细胞内抗氧化防御系统 2

1.2.1酶系防御系统 2

1.2.2细胞内非酶系防御系统 2

1.2.3 CWI途径 2

1.3ICT1基因的概述 3

1.4ROS与疾病的发生 4

1.5论文研究的意义 4

第二章 材料和方法 5

2.1 实验材料 5

2.2 实验方法 7

2.2.1稀释点样实验 7

2.2.2ROS测定 8

2.2.3 荧光定量PCR测定 8

2.2.3 电镜扫描 9

2.2.4 磷脂提取及色谱检测 10

2.2.5 Western Blot试验 10

第三章 结果分析与讨论 13

3.1 重组菌株高氧耐受性机制 13

3.1.1稀释点样实验 13

3.1.2菌株生长速率 13

3.1.3 胞内活性氧检测 14

3.2. ICT1Δ的高氧敏感性与OSR系统无关 15

3.2.1抗氧化酶RT-PCR 15

3.2.2甘油含量 15

3.2.3海藻糖含量 16

3.3 ICT1基因缺失对CWI途径的影响 16

3.3.1 WB 17

3.3.2 TEM分析 18

3.4 ICT1基因缺失质膜成分变化 18

第四章 总结与展望 20

4.1总结 20

4.2展望 20

参考文献 21

致谢 24

第一章 绪论

1.1 活性氧

1.1.1 ROS的产生与类型

活性氧(reactive oxygen species , ROS)是生物体内性质比较活泼的含氧化合物的总称，细胞内发生氧化和还原反应时都会产生大量的ROS，具有消毒和信号传导等功能。ROS主要是由进入生物体内的氧产生的，主要的类型见表1-1

表1-1ROS的主要种类

当酵母细胞感应到环境的改变如氧化胁迫时，即在线粒体、质膜、过氧化物酶体以及质外体等多处部位产生ROS ^[1]，主要场所是酵母细胞的线粒体。在能量的转换过程中，少量的电子会过早地“泄漏”到O₂中，呼吸链电子传递时这些位点产生电子漏，将单个电子传递给附近的氧分子，从而生成超氧阴离子，超氧阴离子在线粒体内膜两侧的不同超氧化物歧化酶的催化下转化成H₂O₂，进而转化成具有极强破坏力的·OH^[2]。

1.1.2 ROS对生物大分子造成的氧化损伤

在酵母细胞中，ROS的产生与消除的动态平衡并不是具有绝对的稳定性，会被盐、重金属、强光等一系列的胁迫所破坏。过多的ROS可能会使核酸、蛋白质、脂质等生物大分子受损和破坏生物膜的流动性。此外，还会使酵母细胞中的酶失活和蛋白质发生交联反应，延缓蛋白质的合成进程，最终导致酵母细胞凋亡。

ROS对于机体蛋白的损害强度是由ROS的浓度和在机体的扩散程度两者共同决定的。ROS对蛋白质的损伤途径并不是单一的，但是最终的结果都会造成蛋白的多种类型的修饰。一般认为，自由基对氨基酸造成的机体损害具有较强的感受能力，其中芳香族以及含硫氨基酸的感受能力最为突出。因此，自由基对特定氨基酸侧链造成的影响也各有不同^[3]。积累的ROS一般通过两种方式断裂蛋白质的肽链：一是水解—肽键发生断裂，二是ɑ-碳位点断裂—此位点相对比较容易发生反应。由于具备特殊的结构和强氧化性，ROS几乎可以和所有的机体蛋白发生反应导致机体蛋白的病变，从而损害到生物的机体功能^[4]。

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