论文总字数：26925字

摘 要

为了研究甲硝唑（Mtz）浓度差异对转基因斑马鱼（Danio rerio）胚胎发育及T淋巴细胞的影响，我们利用Tol2转座系统构建了一个T淋巴细胞稳定表达荧光蛋白的转基因斑马鱼品系（lck:NFSB-mVenus），所选用的启动子是斑马鱼的lck酪氨酸激酶启动子，然后将大肠杆菌的硝基还原酶NFSB基因与黄色荧光蛋白（mVenus）序列进行连接。我们收集亲代转基因斑马鱼（lck:NFSB-mVenus）同野生AB型斑马鱼杂交产下的胚胎，从中挑选出成功表达黄色荧光蛋白的胚胎，简单随机地将甲硝唑浓度分成4组：0 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L甲硝唑。于浓度梯度下孵育24及48 h，研究记录并分析不同浓度甲硝唑对斑马鱼胚胎孵化、发育及致死率。通过荧光显微镜观察转基因斑马鱼胚胎T淋巴细胞消融及荧光表达情况。结果显示，孵化5 d的转基因斑马鱼胚胎在10 mmol/L的Mtz浓度下加药24 h之后，荧光强度明显减弱直至消失，不仅如此胚胎的畸形率及死亡率均较低。本实验的目的在于获得宝贵的用于研究异种移植物的动物模型，这是一种有机会运用于人类肿瘤细胞生长、分化、干细胞群多能性、药物治疗反应以及器官移植免疫排斥研究的珍贵模型。

关键词：斑马鱼 lck基因 甲硝唑 细胞消融 T淋巴细胞

Effect of metronidazole on the development of transgenic zebrafish (lck: NFSB mVenus)

ABSTRACT

To study the effects of Metronidazole (Mtz) concentration difference on embryonic development and t lymphocyte in transgenic zebrafish (Danio Rerio) , a transgenic zebrafish strain (lck: NFSB-mVenus) stably expressing fluorescent protein in t lymphocyte was constructed using Tol2 transposon system. The selected promoter was the lck tyrosine kinase promoter of zebrafish, the nitroreductase NFSB gene of E. coli was then linked to the Yellow fluorescent protein sequence. We collected embryos produced by cross-breeding between parental transgenic zebrafish (lck: NFSB-mVenus) and wild-type AB zebrafish, and selected those that successfully expressed Yellow fluorescent protein.We simply and randomLy divided metronidazole concentration into 4 groups: 0 mmol/L, 10 mmol/L, 15 mmol/L, 20 mmol/L metronidazole.The effects of different concentrations of metronidazole on incubation, development and mortality of zebrafish embryos were recorded and analyzed after incubation for 24 and 48 hours. T lymphocyte ablation and fluorescence expression of transgenic zebrafish embryos were observed by fluorescence microscope. The consequences confirmed that the fluorescence intensity of transgenic zebrafish embryos incubated at the concentration of 10 mmol/L Mtz for 24 hours was significantly decreased until disappearance. Not only that, the malformation rate and mortality rate of embryos are relatively low. The aim of this experiment is to obtain valuable animal models for the study of xenografts, which is a valuable model that has the opportunity to be used in the study of human tumor cell growth, differentiation, pluripotency of stem cell population, drug therapy response, and immune rejection of organ transplantation.

Keywords: zebrafish; lck gene; metronidazole; cytoablation; T lymphocyte

目 录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 绪论 1

1.1引言 1

1.2甲硝唑（Mtz） 2

1.3 Tol2转座子体系 2

1.4斑马鱼胚胎发育毒性评价方法 3

1.5 转基因斑马鱼（lck：NFSB-mVenus）的潜在应用及优缺点 3

第二章 材料与方法 5

2.1 实验材料 5

2.1.1 菌株 5

2.1.2 载体 5

2.1.3 实验动物 5

2.1.4主要试剂、酶和试剂盒 5

2.1.5 主要耗材及仪器 5

2.2 实验方法 6

2.2.1引物酶切位点的设计和引物合成 6

2.2.2. E.coli基因组的提取、NFSB分子克隆及纯化回收 6

2.2.3 mVenus基因的分子克隆及纯化回收 8

2.2.4 融合PCR获取基因NFSB-mVenus 片段 9

2.2.5 NFSB-mVenus双酶切插入转基因载体pTol2-SVPA 10

2.2.6 获取转基因表达载体pTol2-lck-NTR-mVenus 11

2.2.7配制LB固、液体培养基 13

2.2.8 CaCl₂制备感受态大肠杆菌 13

2.2.9 连接产物的转化 14

2.2.10 阳性菌体的筛选和质粒的提取 14

2.2.11 重组表达载体的构架、转化和质粒的提取鉴定 14

2.2.12 转基因斑马鱼的构建 14

2.2.13 动物模型的制备及施加不同浓度的甲硝唑 17

第三章 结果与分析 18

3.1 获得转基因（lck：NFSB-mVenus）斑马鱼 18

3.2 不同浓度甲硝唑对野生型斑马鱼胚胎孵化、致畸致死率的影响 20

3.3 不同浓度甲硝唑对转基因斑马鱼T淋巴细胞消融情况 21

3.4 结论及展望 22

参考文献 24

致谢 28

第一章 绪论

1.1引言

在有脊椎生物模型在遗传学领域的应用中，斑马鱼(Danio rerio)具有无可替代的地位，因为它能够通过各种药物的高通量发育毒性试验^[1-3]。我们可以在实验室中轻松培养繁殖力高的斑马鱼。此外，斑马鱼在发育过程中胚胎和鱼体呈透明，可以直接连续的观察其完整的发育过程，易于各种具有荧光特性蛋白发光的生理观察，方便获取实验所需要的各项生理指标数据和原始图像。克服了小鼠胚胎发育时变化不明显以致难以观察的自有缺陷。斑马鱼具有的诸如高繁殖力、低成本和光学清晰度等优秀特质，使其成为研究细胞及器官移植的理想模型^[4]。尤其是在受精后的48至72 h内，斑马鱼具有较高的药物代谢能力，因此斑马鱼非常适合用于大多数药物开发时毒理的研究^[5-6]。斑马鱼在遗传同源性上与人类高度相似，至少有百分之七十的人类基因和大概百分之八十二的潜在人类疾病相关基因同斑马鱼至少有一个相似的直系同源物^[7]。这个典型的模式生物也同样非常适合于遗传学的转基因操作，能够相对轻松地实现那些参与药物代谢的目的基因的添加或去除^[8]。然而，对于某些特定的化学品和化学类别，不同的模型生物之间的毒性反应可能不一致。

在已有的成功培育的斑马鱼模型中，成功表达了由特异性启动子控制的硝基还原酶基因（NTR），产生了预期中的对特定组织器官的特异性^[9-10]。当我们使用含有硝基官能团(一般是甲硝唑)的无毒前药治疗动物，硝基还原酶能够将甲硝唑还原成具有细胞毒性的交联代谢物，从而引起特定组织器官的特异性消融。此前众多科学家已经成功开发了在一系列组织中表达硝基还原酶的斑马鱼品系，包括肝细胞、心肌细胞、胰岛细胞、卵母细胞和精原细胞等^[11-14]。硝基还原酶启动子的特异性以及其交联代谢物具有的细胞毒素的抑制对于防止其他组织消融和非靶向效应是十分重要的，斑马鱼由于缺乏内源性硝基还原酶表达使得它们非常适合被建立成这种特定组织器官消融的模型。为了进一步研究硝基还原酶在药物毒性和代谢中的作用，使用已经成功开发的用于基于NTR的组织特异性细胞凋亡的转基因斑马鱼模型无疑是一种理想的选择^[15]。

1.2甲硝唑（Mtz）

甲硝唑(Mtz)作为一种在厌氧性细菌感染方面具有强大作用的合成抗菌药^[16-17]，当其与大肠杆菌的硝基还原酶(NTR)发生特异性结合时，会形成具有细胞毒性的交联代谢物，因此可被应用于特异性消融细胞或组织的强有力的研究工具中，特别是在斑马鱼模型中进行再生研究^[18]。Mtz/NTR系统的适用性基于两点，一是Mtz对靶细胞无毒且耐受，二是NTR可将Mtz转化为细胞毒性产物^[19]。虽然此前在一些期刊论文中已经报道了对真核细胞的不良生物效应，但甲硝唑的毒理机制尚未被揭示。对于有脊椎哺乳动物的人类而言，Mtz的不良生物效应是轻微的，但基于其对细菌是一种经证实的致癌诱变剂，确实对人类细胞系具有遗传毒性，并且在其他动物模型上也表现出了致癌作用，因此许多人担心其可能的诱变和致癌效应^[20]。迄今为止，由于缺乏有力的流行病学研究，Mtz依旧被排除在人类致癌物大家族之外。此外，大量无限制地使用这种药物肯定会引入环境中，它们对生物体的不良反应至今仍未得到很好的解决。

1.3 Tol2转座子体系

青鳉（Oryzias latipes）是一种大量分布于东亚和东南亚地区静水或缓流淡水区域的脊椎鱼类。1975年，日本的Tomita及Koga等从基因突变层面研究青鳉出现的白化病，发现其中一种突变体产生白化病的原因是编码酪氨酸酶基因的位置上被插入了一段大小为4.7 kb的序列，而后来这个序列就被命名为Tol2，这个转座子随机地分布在青鳉的全部基因组中，且所有拷贝长度都约为4.7 kb^[21-23]。

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