论文总字数：15622字

摘 要

异甘草苷拥有良好的抗溃疡和抗艾滋病病毒的作用，但对其药物毒性评价的斑马鱼动物模型少见报道。本文以转基因斑马鱼品[Tg(fabp 10a：ds Red ds32：EGFP)]为实验对象研究了不同浓度梯度的异甘草苷对斑马鱼胚胎的毒性作用，来探索其最大耐受量。通过浸泡的方式进行透皮吸收给药，在倒置荧光显微镜下通过红色荧光强度观察异甘草苷在模式生物上展现出的肝脏毒性情况，建立了斑马鱼模式动物的浓度梯度毒性评价模型。结果显示，在斑马鱼胚胎模型中，无论是高浓度还是低浓度的异甘草苷，均未发现对斑马鱼胚胎的形态发育、心脏和肝脏产生毒性，无明显的毒理作用。这预示了异甘草苷在临床上的巨大应用前景。

关键词：转基因斑马鱼 异甘草苷 胚胎发育 心肝毒性 毒性评价模型

Study on liver toxicity of isoliquiritin based on transgenic zebrafish

Abstract

Isoliquiritin has good anti-ulcer and anti-HIV effects, but zebrafish animal models for its drug toxicity evaluation are rarely reported. In this paper, the transgenic zebrafish product [Tg(fabp 10a: ds Red ds32: EGFP)] was used as the experimental object to study the toxic effect of different concentration gradients of isoliquiritin on zebrafish embryos to explore its maximum tolerance. Transdermal absorption and administration were carried out by immersion, and the hepatotoxicity of isoliquiritin on model organisms was observed under red fluorescence intensity under an inverted fluorescence microscope, and a concentration gradient toxicity evaluation model of zebrafish model animals was established. The results showed that in the zebrafish embryo model, no matter whether it was a high concentration or a low concentration of isoliquiritin, no toxicity was found to the morphological development of the zebrafish embryo, heart and liver, and there was no obvious toxicological effect. This foreshadows the huge clinical application prospect of isoliquiritin.

Key Words:Transgenic zebrafish；Isoliquiritin；Cardiohepatotoxicity；Embryonic development；

Toxicity evaluation model

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1甘草类药物的药理作用 1

1.1.1常见的甘草黄酮类药物 1

1.1.2甘草黄酮类化合物的活性研究现状 2

1.1.3异甘草苷的活性研究现状 2

1.2斑马鱼简介 3

1.2.1斑马鱼的特征 3

1.2.2斑马鱼的繁殖 3

1.2.3斑马鱼肝脏发育流程 4

1.3斑马鱼在毒理学中的相关应用 5

1.3.1斑马鱼在发育毒理学中的应用 5

1.3.2斑马鱼在肝脏毒性研究中的应用 5

1.3.3斑马鱼在检测中药肝脏毒性中的优势 5

1.4 异甘草苷在斑马鱼胚胎发育中毒性评价的研究内容 6

第二章 实验材料与方法 7

2.1引言 7

2.2实验材料 7

2.2.1斑马鱼的饲养 7

2.2.2主要试剂与耗材 8

2.2.3主要仪器 8

2.3实验方法 9

2.3.1药物与实验溶剂的配制 9

2.3.2实验步骤 9

2.4基于转基因斑马鱼探究异甘草苷的肝脏毒性实验 10

第三章 实验结果与讨论 11

3.1异甘草苷的心脏和形态发育毒性评价结果 11

3.1.1异苷草苷的心脏毒性评价结果 11

3.1.2异苷草苷的形态学发育毒性评价结果 13

3.2异甘草苷的肝脏毒性评价结果 14

3.3实验讨论 15

第四章 结论与展望 16

4.1实验结论 16

4.2展望 16

参考文献 17

致谢 19

第一章 文献综述

1.1甘草类药物的药理作用

1.1.1常见的甘草黄酮类药物

甘草属于豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis fisch.)、胀果甘草（Glycyrrhiza inflata bat.)或光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.)的根和根茎，拥有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓痛镇静、调和诸药的功效^[1]。据现代药理学研究发现，甘草还具有治疗炎症、拮抗癌症细胞、抗细胞氧化、治疗病毒性肺炎、降血压的作用。

作为甘草中最重要的化学成分--甘草黄酮类物质，具有非常广阔的临床研究前景^[2]。甘草中常见的一些黄酮类物质包括甘草苷，异甘草苷，甘草素和异甘草素等。

表1-1.甘草中黄酮类化合物的相关信息

1.1.2甘草黄酮类化合物的活性研究现状

甘草黄酮类化合物可以抑制癌变，阻碍癌症细胞生长繁殖，同时影响其组织内调控细胞凋亡的蛋白质表达，从而诱导癌症细胞凋亡^[3][4]。与此同时，人们还发现甘草黄酮类物质的抗癌症细胞作用与其抗氧化作用有着密切联系：因为自由基引发了脂质的过氧化反应，同时又和核酸，蛋白质等大分子物质作用从而导致DNA双链断裂和碱基序列的改变，造成了基因突变，引发了癌症^[5]。然而甘草黄酮类化合物可以消除多种自由基，抑制脂质过氧化反应，因此能够起到抗肿瘤作用。甘草黄酮类物质也有抗溃疡作用，临床上十二指肠和胃溃疡是比较常见的胃肠疾病。Jalilzadehamin等^[6]构建了HEGG引起的瑞士小鼠胃溃疡模型, 选取奥美拉唑30 mg/kg和西米替丁100 mg/kg为阳性对照, 研究光果甘草对消化溃疡的干预效果。结果发现，相较于阳性对照组，其治疗溃疡的效果显著，且急性损伤较小。甘草黄酮类化合物还有较好的止咳作用，经常和其他药物复方配伍来用于治疗呼吸系统相关的疾病，其中甘草苷和甘草苷芹糖是当中最主要的镇咳物质。朱一亮，谢强敏等人通过实验证明^[7]，甘草黄酮类物质能十分有效的抑制辣椒素诱导的豚鼠咳嗽反射，且其作用时间可达6个小时以上，并进而推测其作用机制或许是通过直接阻断VR1受体或间接影响内源性阿片的释放。

1.1.3异甘草苷的活性研究现状

异甘草苷是甘草中重要的黄酮类化合物，外观为黄色结晶粉末，别称为异苷草甙，拥有良好的抗溃疡和抗艾滋病病毒的药理作用，特别当发现其具有抗艾滋病病毒的作用后，对于异苷草苷毒性的研究越来越多^[8][9]。具体地，日本学者渡边和浩^[10]等人发现异甘草苷能够增强机体T细胞对于艾滋病病毒的拮抗作用，同时证明了拮抗艾滋病病毒的活性比甘草酸强100倍。张玉辉^[11]的研究发现，在西药治疗的基础上联用甘草泻心汤治疗艾滋病患者能够明显提高治疗效率。除此之外，已报道异甘草苷能够通过促进血管新生来有效促进斑马鱼皮肤伤口愈合，在血管内皮细胞模型中，异甘草苷能够促进HUVEC细胞的增殖、迁移和小管形成，在斑马鱼血管损伤模型中，异甘草苷有效促进斑马鱼体节间、肠下网、头部、眼部血管的再生等等^[12][13]，异甘草苷作为一种甘草根的水提物，常以毒性低来说明，但其实对于异甘草苷的毒性方面评价至今未有相关报道，因此本文首次基于转基因品系斑马鱼来研究异甘草苷的发育毒性，具体表现为心脏、肝脏、形态等，为其日后的应用提供良好的客观依据。

1.2斑马鱼简介

1.2.1斑马鱼的特征

斑马鱼（zebrafish）是一种原产于南亚地区的小型热带鱼，其全身遍布多条深蓝色纵纹，主要分布在巴基斯坦、孟加拉国、印度等水域。因为其在成群结队的活动时如同斑马群一般，所以有了斑马鱼的称谓。斑马鱼体长大约4~6cm，躯体延申而略显纺锤形，背部显示为橄榄色，尾鳍较长且呈叉形。因为斑马鱼的养殖简便，排卵量充足、体外受精、繁殖周期较短、胚胎透亮易观察等优点^[14]，较小鼠家兔等动物在药物早期临床研究中需求样品药物量小且试验周期较短，能快速建立药物毒性模型，很快就发展为分子生物学、遗传学、毒理学等生命科学学科的模式动物^[15]。在过去的30多年，斑马鱼作为一种高效的药理实验模型，基因组已经完全测序，研究发现斑马鱼基因组与人类的基因组相似性极高，拥有87%的同源性^[16]，已经成为了一个研究当今人类多种疾病发展的具有相当大潜力的动物模型。另外据权威数据统计，人体中有70%的基因在斑马鱼的基因组里有同源基因^[17]。

1.2.2斑马鱼的繁殖

在实验室中，我们选用5到6个月大的斑马鱼进行培育繁殖。由于斑马鱼这种这种卵生鱼类繁殖能力强，只需控制其培养温度在28.5℃左右，在这个温度下，斑马鱼一年四季均可产卵进行繁殖培育。由于斑马鱼属于群居生物，在平时的培育过程中，需要将雌雄斑马鱼分开进行饲养，以便其在需要进行繁殖时拥有较高的排卵活性。当我们准备进行繁殖培育时，在前一天晚上将公母斑马鱼以1:1或2:1的比例捞出置于产卵盒中。这种特定的产卵盒由于中间带有可拆卸的挡板，因而可以将公鱼母鱼分开；此外因为在其底部含有带缝隙的隔板，且斑马鱼的鱼卵其直径大概在1mm左右，比重也比水大，可以从缝隙中落入产卵盒底部，防止斑马鱼误食胚胎的情况发生。之后在第二天清晨在鱼房亮灯后抽取中间的挡板，让原来被挡板隔开的公鱼和母鱼追逐产卵，产卵过程通常在开灯后半个小时结束。在斑马鱼产卵结束后将公鱼和母鱼放回原本的鱼缸中，通常情况下进行受精产卵后的公母鱼至少要一天后才能再度受精产卵。这时我们需要用直径大于鱼卵的一次性塑料吸管吸出产卵盒底部的受精卵置于培养皿中，由于鱼卵十分脆弱，我们需轻轻倒入水清洗鱼卵，反复多次，吸出其排泄物及其他脏物。清洗干净的受精卵我们将其置入0.2g/L的海盐水（即卵液中），放入28.5℃的恒温培养箱中培养。正常的受精卵形态应为饱满、圆润的圆形球体。

1.2.3斑马鱼肝脏发育流程

斑马鱼的肝脏起源于内胚层，在胚胎发育至原肠胚后期时，其内胚层的细胞会首先内卷进入上胚层与卵黄合胞体之间，形成一种较为分散的单层细胞。在其早期的体节发育期间，较分散的内胚层细胞会向前后轴聚集同时形成内胚层棒状结构。待内胚层棒状结构形成后，肝脏的发育便可分为三个时期，分别是肝母细胞特化、肝脏出芽和肝脏生长。在经过大约24hpf后，棒状内胚层前端的腹侧会分出一团突出的细胞，而这团细胞就开始分化为肝母细胞。此时新生的肝母细胞中的上皮粘附蛋白的表达会降低，原因是为了与其原始的消化管分离。在这之后，新生的肝母细胞形态开始发生变化，且暂时让上皮细胞形态转化为间充质样细胞形态，进而穿过内胚层基底膜形成肝脏原基。在出芽完成之后，肝脏原基会向左生长，肝脏的出芽过程大约在34hpf后停止。在完成出芽后肝脏就进入了生长时期，同时将会伴随着肝实质细胞的分化和胆管网络的形成。到了96hpf时，斑马鱼的肝脏发育基本成形，肝脏发育成两叶，同时可以发挥其大部分的功能^[18]。

图1-1.斑马鱼肝脏发育流程

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