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人源Cathepsin S体外表达体系的设计毕业论文

 2021-06-08 12:06  

摘 要

为了提高前药的靶向性以及释药的效果,目前,能够靶向病灶部位并能够针对病灶部位进行特异性释药的刺激响应性前药正受到广泛研究。因为人体细胞内存在有大量的组织蛋白酶使得其中酶响应性前药有良好的开发前景。但是,目前对前药在体内与酶的作用方式并不太了解,其机制尚不明确,限制了酶响应型前药的发展。本次设计即通过建立其中一种组织蛋白酶——Cathepsin S的体外表达体系,为以后进一步研究前药在体内的释放机制提供条件。本次设计分别构建了标签蛋白在N端和C端的原核表达载体和真核表达载体,以寻求最佳的表达系统。

关键词:前药;靶向;酶敏感;CathepsinS;体外表达体系

Abstract

In order to improve the targeting and the release effect of prodrugs. The stimulation response prodrugs that can target the lesion site and release specificity are being studied extensively recently. Among these prodrugs, enzyme response prodrugs have great prospects in the condition of the large number of cathepsins in cells of human body. However, currently how prodrugs and enzymes interact in vivo have not been completely understood. And the mechanism is not clear. It limited the development of prodrugs. So this design provide a possibility for further study of the release mechanism of prodrugs in vivo though establishing the protease expression system of one of the cathepsins——Cathepsin S. This design build a prokaryotic expression and a eukaryotic expression with the tagged proteins attached in the N-and C-term respectively. Because the different positions of tagged proteins may have different impaction to expression of proteins.

Key words:prodrugs; targeting; enzyme response; Cathepsin S; gene expression system

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1前药简介 1

1.2前药的研究进展 1

1.3智能纳米颗粒前药 2

1.3.1温度响应性药物释放系统 2

1.3.2光响应性药物释放系统 2

1.3.3电场响应性药物释放系统 2

1.3.4磁响应性药物释放系统 3

1.3.5 PH响应性药物释放系统 3

1.3.6酶响应性药物释放系统 3

1.4 Cathepsin家族简介 4

1.5 Cathepsin S 简介 5

1.6 本次设计目的 6

第2章 实验设计依据 6

2.1设计要求 6

2.2设计依据 6

2.2.1载体质粒的选择 6

2.2.2酶切位点的选择及依据 8

2.2.3引物设计依据 9

2.2.4 建立cDNA文库 10

2.2.5宿主细胞的选择及依据 10

2.2.6 Western blotting抗体选择依据 13

第3章 Cathepsin S基因分析和克隆 13

3.1获取目的基因 13

3.2酶切位点分析 15

3.2.1目的基因酶切位点分析 15

3.2.2质粒多克隆位点分析 17

3.3 引物设计 17

3.4 重组质粒图谱 21

第4章 后期应用手册 22

4.1 获取目的基因和 建立cDNA文库 22

4.2 目的基因与原核表达载体pcDNA3.1( )/myc-His A、pcDNA4/HisMax A的连接与转化 22

4.3 重组质粒提取及双酶切鉴定 23

4.4 融合蛋白的诱导表达 23

4.5融合蛋白的表达形式的确定 23

4.6 融合蛋白纯化 23

4.7 Western blotting 检测目的蛋白 23

4.8真核表达载体pcDNA3.1( )/myc-His A -Cat S和pcDNA4/HisMax A -Cat S的构建 24

第5章 讨论 24

5.1 载体标签的位置 24

5.2 融合蛋白表达形式 24

第6章 小结 24

参考文献 26

致 谢 28

附录 29

第一章 绪论

前药作为一种优秀的给药模式,不仅可以保持药物原来的治疗效果,还可以克服药物的一些缺点。因此将一些有良好药效但体内吸收效果不好的药物开发成前药,一直被大量学者广泛研究。通过前药修饰后,药物的生物利用度,溶解性,化学稳定性等都得到了很大的改善。不仅如此,前药也能够增加药物在病灶的浓度,尤其是细胞内的浓度。因此前药在靶向治疗的发展过程中也起到了重要的推动作用,特别是利用前药原理开发出来的智能纳米颗粒前药在肿瘤的靶向治疗中有着很好的应用前景。这种纳米前药可以响应外界的刺激信号,从而控制药物的释放。这些刺激信号包括温度、PH、酶等。

1.1前药简介

前药是指药物经过化学结构修饰后得到的在体外无活性或活性较小、在体内经酶或非酶作用,释放出有活性的药物从而发挥药效的化合物[1]。可以改善药物在体内的物理化学、药代动力学、药剂学性质。例如,有些药物难以穿过体内的各种生物屏障,还有一些化学性质不稳定、水溶性差、或者有一定毒性、在作用部位难以达到有效浓度等不良性质,经过前药修饰后可以使这些不良特性得到改善,更加满足于实际的临床需要。目前,已经有很多前药被实际的应用于临床并收到了良好的效果。

1.2前药的研究进展

前药由原药和载体两部分组成,近年来,前药的发展主要依托于载体的发展。而载体的发展经过了简单化学小分子到特异靶向性载体到抗原基因导向载体,发展速度十分迅猛。调查表明,有大概1/3的药物在研发时有很好作用,但由于在体内吸收或分布效果不好而被淘汰[2]。目前前药根据其载体形式主要分为两种:(1)传统小分子载体前药;(2)高分子载体前药。

传统小分子载体前药包括有①脂肪酸和醇为载体的前药,如对乙酞氨基酚类前药,这类前药可以改善药物的脂水分布系数从而提高药物的生物利用度;②氨基酸为载体的前药,将氨基酸与药物连接,能够促进药物的吸收,有时还能提高药物的靶向性;③磷酸基或磷酸酯为载体的前药,这类前药可以提高药物的水溶性,如磷苯妥因在3位N上的磷酸基成钠盐,提高了水溶性[3];④以葡萄糖苷等天然糖分子为载体的前药。因为体内有一套系统可以特异的识别天然糖分子,所这类前药具有细胞特异靶向性作用。

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