摘 要

二十二碳六酸（DHA）是ω-3脂肪酸，它是人脑，大脑皮层，皮肤和视网膜的主要结构组分。据我们所知，DHA是大量脂肪酸脱氢酶（脂肪酸去饱和酶）催化延长的反应和生物合成，但最近研究了一类海洋细菌，它们产生DHA或EPA，还有一种非常特殊的方法来延长长链多不饱和脂肪酸长链，这种脂肪酸和脂肪酸脱氢酶的延伸是独立的。在这种新方式，聚酮化合物合成酶（PKS）和这种酶的存在由细胞质中发现的许多基因组成，并且可能几乎没有同源的脂肪酸脱氢酶，但脂肪酸合酶（FAS）具有相似的保守结构域，即聚酮化合物合成途径（PKS途径）

本课题主要依据裂殖壶菌的鉴定，鉴定裂解碳链控制因子ER Schizochytrium sp。 PKS酶的功能，主要是裂解控制碳碳双键裂殖壶菌。 PKS酶在ER敲除上，即将外源基因片段转化为ER，以替代博来霉素裂解菌的裂解。通过同源重组方法，包括上游和下游同源臂构建，裂殖壶菌能力制备，筛选ER缺陷菌株，最终验证脂肪酸发酵的变化情况。

关键词：二十二碳六烯酸 裂殖壶菌 碳链控制因子 电转化 基因敲除

Study on the Effects of Eneyl Reductase on the Production of Oil in

Abstract

Docosahexaenoic acid (DHA) is an omega-3 fatty acid, which is the major structural component of the human brain, the cerebral cortex, the skin and the retina. In our perception, DHA is a number of fatty acid desaturase (fatty acid desaturase) catalytic extension of the reaction of biological synthesis.However, a class of marine bacteria. recently studied, also produced DHA or EPA. There is also a very particular way to extend the long chain of long chain polyunsaturated fatty acids.This way is independent from fatty acid dehydrogenase and fatty acid extension. In this new pathway, a polyketone compound synthase (PKS), which is present in the cytoplasm and consists of polygenes, is found to be almost homologous to fatty acid dehydrogenase. But this fatty acid synthase (FAS) has a similar conserved domain name, the polyketide synthase pathway (PKS pathway)

Based on the culture of Schizosaccharomyces pombe, the function of the carbon chain control factor (ER) on the PKS enzyme was identified, which mainly controlled the PKC enzyme to control the carbon and carbon double bond Knockout, that is to say, through the method of homologous recombination of the exogenous gene bleomycin fragment into Schistosoma japonicum to replace the ER study, including the construction of upstream and downstream homologous arm, Schistosoma japonicus competent preparation, ER defects Type strains were screened and the final fermentation was carried out to verify the changes of their fatty acids.

Key Words: DHA; Schizochytrium sp. HX-308; ER; electroporation; gene knock-out

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1DHA概述 1

1.1.1 DHA简介 1

1.1.2 DHA的生理功能 1

1.1.3代谢合成 2

1.2.聚酮合酶途径 3

1.2.1PKS（聚酮合酶）途径概述 3

1.2.2聚酮合酶分类 4

1.2.3 PKS 途径中关键功能基因的类型 4

1.3.同源重组 5

1.4.双交换 6

1.5.电转化法 7

1.6.总概述 7

第二章 材料与设备 8

2.1实验主要仪器 8

2.2 实验主要试剂 8

2.3实验用菌株、质粒 10

2.4实验所用到的引物 10

2.5培养基 10

2.5.1 E.coli培养基 11

2.5.2 裂殖壶菌培养基 11

第三章 实验方法 12

3.1 外源DNA制备（PBS-Zeo-ER） 12

3.1.1 裂殖壶菌基因组的提取 13

3.1.2 ER上下游同源臂的构建 13

3.1.3 目的基因片段的获取 16

3.1.4 基因操作相关实验方法 16

3.2裂殖壶菌感受态的制备 17

3.3 裂殖壶菌的电转化方法 17

3.4 ER缺陷型菌株筛选 17

3.5基因工程菌培养及产物检测 18

3.5.1细胞生物量的测定 18

3.5.2油脂含量的测定 18

3.5.3 脂肪酸分布检测 18

第四章 结果与讨论 20

4.1 ER-UP、ER-DOWN与pMD19-T Simple的连接 20

4.1.1 裂殖壶菌基因组片段ER上下游PCR结果 20

4.1.2 裂殖壶菌基因组片段ER上下游PCR回收结果图 20

4.1.3 菌落PCR验证图 21

4.1.4 pMD-ERup、pMD-ERdown质粒提取图 21

4.1.5 质粒pMD-ERup、pMD-ERdown的双酶切验证图 22

4.2 PBS-Zeo载体与ER-UP的酶切与连接 23

4.2.1 PBS-Zeo质粒提取结果 23

4.2.2 质粒PBS-Zeo、pMD-ERup的双酶切验证图 23

4.2.3 菌落PCR验证图 24

4.3 PBS-Zeo-ERup载体与ER-DOWN的酶切与连接 24

4.3.1 PBS-Zeo-ERup质粒提取结果 24

4.3.2 质粒PBS-Zeo-ERup、pMD-ERdown的双酶切验证图 25

4.3.3 菌落PCR验证图 25

4.3.4 质粒PBS-Zeo-ER的双酶切验证 26

4.4裂殖壶菌ER基因的敲除 26

4.4.1 质粒PBS-Zeo-ER的双酶切回收 26

4.4.2 ble基因、目的基因PCR验证图 27

4.5转化菌株生长性能考察 28

4.5.1 生理形态变化分析 28

4.5.2 脂肪酸组分变化分析 29

第五章 结论与展望 31

5.1 结论 31

5.2 展望 31

参考文献 32

第一章 文献综述

1.1DHA概述

1.1.1 DHA简介

二十二碳六烯酸（DHA）是ω-3脂肪酸，其是人脑，大脑皮层^[1]，皮肤和视网膜的主要结构成分^[2]。它可以由α-亚麻酸合成，或直接从母乳（母乳），鱼油或藻油中得到。

图1-1DHA结构式

图1-2 DHA的结构

DHA的结构是具有22碳链的羧酸和六顺式双键的二十二碳六烯酸，第一个双键位于来自欧米茄末端的第三个碳其简单的名字是十八烷酸，其系统名称是全顺式二十四碳-4,7,10,13,16,19-六烯酸，其名称为22：6（n-3），命名为的脂肪酸。大多数DHA在鱼和多细胞生物体中获得冷水海洋食物来自光合和异养微藻，并且越来越多地集中在生物体中，进一步它们在食物链上。 DHA也从微藻商业化制造：隐孢子虫（Crypthecodinium cohnii）和裂殖壶菌属（Schizochytrium）的另一种。使用微藻制造的DHA是素食者。一些获得海鲜的动物通过新陈代谢来减少DHA，而在饮食中获得DHA。然而，在严格的食草动物和不吃海鲜的食肉动物中，DHA由α-亚麻酸内部生产，一种由植物制造的更短的ω-3脂肪酸（并且也存在于从植物获得的动物产品中）。有限数量的二十碳五烯酸和二十二碳五烯酸是年轻女性和男性中α-亚麻酸代谢的可能产物^[3]，尽管与女性相比，DHA难以在男性饮食背景中检测到，这说明DHA的重要性生产发育中的胎儿和健康的母乳。妇女的转化率高出15％，口服避孕药具有10％的DHA水平。DHA是脑磷脂和视网膜中的主要脂肪酸^[4]。虽然DHA在阿尔茨海默病机制中的潜在作用正在积极研究中，但是含有DHA的鱼油补充剂的研究未能支持预防心血管疾病的报道。

1.1.2 DHA的生理功能

相关图片展示：