摘 要

糖类物质广泛存在于生物体内，虽然含量较少但在生命活动中起着至关重要的作用。高效液相色谱-荧光检测法（HPLC-FD）是一种重要的分离检测工具，其分析范围广、检测灵敏度高。但对于无荧光基团的化合物，通常需要进行荧光标记。

本文介绍了羰基化合物的荧光标记以及高效液相色谱-荧光检测法（HPLC-FD），并结合响应曲面法（RSM）对胺氧基香豆素对醛基衍生化条件进行优化。本文利用香豆素类荧光衍生试剂与模型聚糖麦芽七糖在酸性条件下进行反应。根据RSM中Box-Behnken 中心组合实验设计利用Design Expert软件对实验进行设计与分析以及模型验证，最终确定模型聚糖麦芽七糖与4-羟胺基甲基-7-羟基-香豆素的衍生化反应最佳条件为：反应摩尔比600 : 1、反应温度67 ℃、反应pH 2.90、反应时间5.16 h；与4-羟胺基甲基-6-氯-7-羟基-香豆素的衍生化反应最佳条件为：反应摩尔比50 : 1、反应温度75 ℃、反应 pH 3.0、反应时间3.7 h。

关键词：香豆素、聚糖、荧光衍生、RSM、HPLC-FD

Abstract

Carbohydrates are widely found in organisms, although the content is less, but play a vital role in life activities. High performance liquid chromatography with fluorescence detection (HPLC-FD) is an important separation and detection tool, which has a wide range of analysis and high sensitivity. However, it is often necessary to carry out fluorescence labeling for compounds without fluorescence.

In this paper, the fluorescence labeling of carbonyl compounds and high performance liquid chromatography fluorescence detection (HPLC-FD) were introduced, and the conditions for the derivatization of aldehyde groups were optimized by the response surface methodology (RSM). The reaction of the model of carbohydrates with fluorescent derivative happened in acid condition.According to the experimental design of Box-Behnken central composite design using expert design software to design and analyze the experiment and model validation, Finally determine the optimum conditions for the derivatization reaction model of carbohydrates and 4-((aminooxy)methyl)-7-hydroxy-coumarin as: Reaction molar ratio 600:1, reaction temperature 67 ℃, reaction pH 2.90, reaction time 5.16 h; And 4-((aminooxy)methyl)-6-chloro-7-hyd- -roxy-coumarin derivatization reaction optimum conditions as reaction molar ratio of 50: 1, reaction temperature: 75 ℃, the reaction pH 3.0 and reaction time: 3.7 hours.

Key words: chitosan, fluorescence derivatization, RSM, HPLC-FD

目 录

第1章 绪论 1

1.1 概述 1

1.2 常用的聚糖分析方法 1

1.2.1 核磁共振法（NMR） 1

1.2.2 毛细管电泳法（CE） 1

1.2.3 质谱法（MS） 2

1.2.4 色谱法 2

1.3 小结 4

第2章 荧光衍生法及其原理 5

2.1 荧光衍生法原理 5

2.2 荧光衍生试剂 5

2.2.1 氨基吡啶类衍生试剂 5

2.2.2 丹磺酰肼 6

2.2.3 芴甲氧基羰酰肼 6

2.2.4 以花菁为荧光团的肼试剂 6

2.2.5 苯并噁二唑类荧光衍生试剂 7

2.2.6 芳香胺类 7

2.2.7 香豆素类 7

2.3 衍生方法 8

2.3.1 还原胺化法 8

2.3.2 迈克尔加成 9

2.3.3 肼化学法 9

2.3.4 肟化法 10

2.4 小结 10

第3章 衍生反应条件的优化 11

3.1 化学计量学 11

3.2 实验设计方法 11

3.2.1 单因子控制变量法 11

3.2.2 正交试验设计 12

3.2.3 均匀实验设计 12

3.2.4 响应曲面法 12

3.2.4.1 响应曲面法简介 12

3.2.4.2 响应面法的应用 13

3.2.4.3 响应曲面设计常用软件 13

3.3 小结 13

第4章 实验部分 14

4.1 实验仪器及药品 14

4.1.1 实验仪器 14

4.1.2 实验药品 14

4.2 实验方法 15

4.2.1 R-OH与麦芽七糖衍生反应条件的优化 15

4.2.2 R-Cl与麦芽七糖衍生反应条件的优化 16

4.3.1 R-OH与麦芽七糖衍生反应条件的优化 16

4.3.1.1 单因素试验结果 16

4.3.1.2 响应面分析结果 19

4.3.1.3 交互作用分析 21

4.3.1.4 优化条件的模型验证 25

4.3.2 R-Cl与麦芽七糖衍生反应条件的优化 25

4.3.1.1 单因素试验结果 25

4.3.2.2 响应面分析结果 26

4.3.2.3 交互作用分析 28

4.3.2.4 优化条件的模型验证 29

4.4 小结 30

第5章 总结与展望 31

参考文献 32

第1章 绪论

1.1 概述

糖类被定义为是多羟基醛或多羟基酮类化合物，或是能水解出上述单位的前体化合物，传统上多指的是有甜味的碳水化合物，其组成可用 (C·H₂O)_n 表示，广泛分布于自然界。糖糖类物质在生命活动过程中有着极其重要的作用，生命体维持生命活动所需的能量主要来源于糖，麦芽糖、蔗糖、淀粉、纤维素等均属糖类。随着对糖和糖复合物研究的深入，糖被认为是与核酸、蛋白质同等重要的生命物质。糖分子大量存在于糖脂、糖被等大分子结构的外部以及细胞膜表面^[1]。糖类物质在生命体中，不仅用于提供能量，而且还参与了多种生命活动，例如，传递生物信息、调节机体的免疫与细胞分化、受精、胚胎发育、血液系统、感染、衰老^[2-5]等。糖是一类特殊的羰基化合物，虽然从定义上讲，糖都是多羟基醛或者酮，但是糖的羰基大多以缩醛或缩酮的方式存在。在一定的条件下，糖的缩醛或缩酮方式与羰基存在方式会相互转变，因而糖具有某些醛酮化合物的性质。

1.2 常用的聚糖分析方法

常用的聚糖检测分析手段主要有：核磁共振法（NMR）^[6]、毛细管电泳法（CE）^[7]、 质谱法（MS）^[8]、色谱法等。

1.2.1 核磁共振法（NMR）

近些年来，核磁共振技术已发展成为聚糖结构分析的最重要的研究手段之一，也只有核磁共振法可对聚糖进行全结构进行表征。自1970 年代 Vliegenthart 等人首次提出 利用¹HNMR 来分析寡糖结构后^[9]，随着同位素标记技术、计算机模拟技术以及核磁共振技术的发展，NMR在糖类结构鉴定已经发展成熟。目前对寡糖 ¹H 和 ¹³CNMR 谱图的解析实验有¹H 的同核相关谱（COSY）、全相关谱（HCOSY）、¹³C 的异核单量子相关谱（HSQC）与二维异核多键相关 谱（HMBC）^[10-11]。但是因为 NMR 法需要的样品的纯度较高，而且所需样品量较大，会对复杂生物样品中低丰度聚糖的检测造成困扰。此外由于聚糖分子较大，会造成NMR 谱图讯号峰严重重叠，导致分子模拟变得极为麻烦，从而制约了 NMR 在聚糖分析研究中的应用。

1.2.2 毛细管电泳法（CE）

在单糖的分析研究中经常用到毛细管电泳分离技术。该技术具备高效、快速、灵敏等优点。该技术通常的做法是，使样品在高电场（不小于750 V/cm ）的作用下通过孔径在 50 至100 μm 的毛细管，根据分析物在外加电压下存在的不同电泳迁移率而得到快速的分离。 由于毛细管电泳法所需要的进样量小（通常为1-50 nL），需要极灵敏的检测系统，因此糖链分析前可进行荧光标记，标记后利用激光诱导荧光检测法（LIF）进行检测，检测限可达 10^-14 甚至 10^-18 mol。除此之外，也可进行离子标签标记，在中性糖中引入电荷基团，这会引起糖类在电场中的迁移，从而增大其分离度。

1.2.3 质谱法（MS）

质谱法是根据不同离子在电场或磁场中运动时所受力的大小不同，会出现不同的运动轨迹，使得不同质荷比 (m/z) 的带电离子被分离开来，从而对离子化样品的质荷比进行检测的一种方法。质谱仪主要由真空系统、进样系统、离子源、质量分析器、检测器和数据处理、记录系统等部件构成，其中以离子源、质量分析器和离子检测器为核心部分^[12]。

20 世纪 90 年代质谱 “软电离” 技术的发现极大促进了极性高、难挥发的糖类聚合物大分子的研究。目前，质谱法因其灵敏度高、分析范围广、可精确测量分子质量等优点，已经成为研究糖链最主要的方法之一。质谱不仅能提供糖链的分子量信息，还能利用多级质谱得到糖链的结构信息，在多级质谱中首先从样品中选择母离子进行逐级轰击分析，若是没有其他物质的干扰，可以获得的更加详尽的糖链结构信息。目前，为简化糖链结构分析，质谱数据库已经建立，常用的糖结构质谱数据库主要有 Carbbank^[13]，KEGG glycan^[13]，EuroCarbDB^[14]，等。