1. 研究目的与意义（文献综述）

1. 课题研究背景及意义

   银杏树为银杏科银杏属植物(gingkgobilbal)是最古老的树种之一，又名公孙树，是我国特产物^[1]。银杏叶作为药用已经有60多年的历史，近10年来国内外对其药理和化学等方面的研究进展迅速^[2-3]。银杏叶提取物是银杏科植物银杏的干燥叶经加工制成的提取物，其制剂是目前国内外畅销的用于治疗心脑血管疾病和老年痴呆症的天然药物之一。目前对银杏利用更加广泛和深入，国内外都开发生产出各种银杏药品、饮料、保健品、食品、化妆品等产品，取得巨大经济效益和社会效益。

   1.1银杏叶生物活性物质提取

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   2. 研究的基本内容与方案

   .研究方案

   2.1活性物质的提取工艺及原理及条件优化

   萃取：萃取，又称溶剂萃取或液液萃取，亦称抽提，是利用系统中组分在溶剂中有不同的溶解度来分离混合物的单元操作。即，是利用物质在两种互不相溶（或微溶）的溶剂中溶解度或分配系数的不同，使溶质物质从一种溶剂内转移到另外一种溶剂中的方法。广泛应用于化学、冶金、食品等工业，通用于石油炼制工业。一般分为固-液萃取和液-液萃取。

   在液-液萃取中当水相和有机相达到化学位相等时即达到萃取平衡。但是在萃取过程中，“平衡”只是暂时的。这种平衡会随着条件的改变而改变。比如某一溶质A存在于水溶液中，在一定条件下该溶液与一种与水不互溶的有机溶剂以一定的相比接触，平衡后A被萃入有机相中，并在水相和有机相的分配达到平衡，此时A在水相和有机相中的平衡浓度分别为[A]和[A’].当温度、相比或水溶液中的A浓度等任何一个条件发生变化，[A]和[A’]都会发生变化，并在新的条件下达到平衡。

   能斯特（Nernst）分配定律认为：当某一溶质在互不相溶的两相分配时，在给定温度下两相达到平衡后，且溶质在两相中分子量相等（分子形式相同），则该物质在两相中的浓度比值为常数。即：

   K_D= ；

   式中 K_D即为分配系数。严格说[A]和[A’]应是活度而不是浓度。

   分液：分液是把两种互不混溶的液体分离开的操作方法。分液使用的仪器是分液漏斗，另外，分液还需要烧杯与铁架台进行辅助。

   在萃取结束后，为将溶质提取出来，一般都要进行分液操作。但是在分液过程中，有时会出现两相乳化不分层的现象，这时候需要进行破乳分层。

   破乳：破乳方法大致分为化学破乳、生物破乳、物理破乳和联合破乳四种方法。

   A.化学破乳：化学破乳主要利用化学剂改变油水界面性质或膜强度来实现破乳。该法应用最 广由于破乳剂选择性较强，化学破乳法的研究主要集中在开发不同种类和结构的破乳剂以及破乳剂与其他试剂的复配等以适应各种复杂的乳液。由于破乳剂自身具有一定的毒性，或是破乳剂在生产或使用过程中需要加入某些有毒有害的溶剂，会对人体和环境造成危害，因此采用化学破乳法时，除了考虑破乳剂的效果外还需考虑破乳剂的生产、使用以及使用后处理的技术可行性、经济合理性以及环境友好性等因素。

   B.生物破乳：该法主要是利用微生物细胞破乳或者利用微生物代谢过程产生的表面活性破乳。生物破乳剂因破乳高效环保等优点在油水分离等领域具有较好的应用前景，已经成为破乳剂研究的热点之一。近年来该领域研究主要集中在微生物的筛选以及影响其破乳能力的因素考察等方面，除寻求具有高效破乳能力的微生物菌种外，还通过微生物与化学破乳剂复配以及不同微生物之间的复配以提高微生物破乳剂的效率及效果。由于对生物破乳剂中有效成分的认识还不够清楚，因此将生物破乳剂用于实际生产还需要进一步探索。

   C.物理破乳：该法主要是采用物理的方法破坏乳液界面膜破坏而实现破乳。目前的研究一方面是对已有破乳方法的改进或将已有的方法进行组合，另一方面是开发新的破乳方法。物理破乳的方法较多，可以分成以下几种：

   a.通过对乳状液施加一定的外力实现油水分离。如离心破乳法、过滤破乳法、重力沉降破乳法、振动破乳法、研磨破乳法、膜润湿聚结破乳法、膜破乳法、过滤破乳等。这类方法一般适用于结构和化学组成较简单的乳状液破乳，而且往往与其他方法联合使用。目前研究较多的是膜破乳法，该方法主要通过过滤作用实现破乳^[14]。虽然其通用性较强，分离效率较高，但膜容易被污染,废弃膜难降解也难回收，导致成本高，且产生环境污染问题。

   b.通过调节温度来改变乳液性状从而实现破乳。如热处理破乳法、冷冻解冻法破乳等。其中冷冻解冻法破乳研究较多。冷冻解冻法对型和型乳状液都具有较好的破乳效果，但对两种体系破乳的机理不同。往往是几种破乳机理同时作用，产生协同破乳作用^[15]。冷冻解冻法对高黏度乳状液具有较好的破乳能力。

   c.用波的能量破坏乳液界面实现破乳，如超声波破乳法和微波破乳法等。其中超声波破乳法是利用超声波自身具有的机械振动及热作用进行破乳，而微波破乳是利用其热效应和非热效应破乳。目前的研究主要集中在破乳条件的探索和优化。虽然两类破乳方法具有破乳率高热均匀和环保节能等优点，但其工业应用还有许多理论和技术问题需要解决。

   D.联合破乳： 用电学和磁学原理使液滴聚结从而达到油水分离的目的。常见的有电解质破乳法和电破乳法等。

   电解质主要由多价金属盐及酸类构成，利用其破乳因能力有限而应用受限，所以其应用受限。因此一般作为破乳剂的添加剂以改善破乳效果。

   常见的电破乳技术有静电破乳、电脉冲破乳和涡旋电场破乳技术等。还有人提出了“脉冲直流电场加电极带绝缘涂层”的技术，但未能实现工业化"。

   大孔树脂吸附：大孔吸附树脂是一类不带离子交换基团的大孔结构的多孔性交联聚合物，主要是以苯乙烯、二乙烯苯为原料，在0.5%的明胶水混悬液中加入一定比例的致孔剂聚合而成，具有良好的网状结构和很高的比表面积，它通过表面吸附、表面电性或形成氢键等作用达到分离提纯的目的^[16]。

   大孔树脂吸附作用是依靠它和被吸附的分子(吸附质) 之间的范德华引力，通过它巨大的比表面进行物理吸附而工作，使有机化合物根据有吸附力及其分子量大小可以经一定溶剂洗脱分开而达到分离、纯化、除杂、浓缩等不同目的。大孔吸附树脂为吸附性和筛选性原理相结合的分离材料。大孔吸附树脂的吸附实质为一种物体高度分散或表面分子受作用力不均等而产生的表面吸附现象，这种吸附性能是由于范德华引力或生成氢键的结果;同时由于大孔吸附树脂的多孔性结构使其对分子大小不同的物质具有筛选作用。通过上述这种吸附和筛选原理，有机化合物根据吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附树脂上经一定的溶剂洗脱而达到分离的目的。

   2.1.1黄酮的提取

   黄酮的提取方法有很多种，常见的有有溶剂提取、超声波提取^[17]、微波提取^[18]、半仿生提取^[19]和酶解法提取^[20],本实验将采取溶剂提取法来提取黄酮。

   银杏黄酮类化合物种类众多，不同结构的黄酮类化合物溶解性差异很大。例如，苷类极性比苷元大，3-羟基苷比相应的7-羟基苷水溶性大，多糖苷比单糖苷水溶性大。根据相似相溶的原理，对苷类和极性较大的苷元，常用极性较大的溶剂，如水、甲醇、乙醇、乙醇-水溶液、丙酮、乙酸乙酯等，对极性较小的苷元则常用乙醚、氯仿等极性较小的溶剂提取^[21]。常用的提取方法有有机溶剂提取、热水提取、碱性条件下提取等。

   有机溶剂提取：目前国内外使用最广泛的银杏中黄酮的提取方法就是有机溶剂提取法，有机溶剂法亦称共沉淀法， 将药物与载体材料共同溶解于有机溶剂中，蒸去有机溶剂后使药物与载体材料共同析出，经干燥即得。甲醇和乙醇是最常用的黄酮类化合物提取溶剂， 乙酸乙酯和丙酮也常用来提取黄酮类化合物^[21]。提取方法有浸渍法、渗漉法、煎煮法和回流提取法。宋国斌等^[22]以水、乙醇、丙酮作为提取溶剂，对银杏外种皮黄酮类化合物的不同提取方法进行了比较研究。结果表明，以乙醇作为提取溶剂，采用回流提取法提取银杏外种皮黄酮类化合物的效果最好，提取率超过84%。有机溶剂提取黄酮的优点是其选择性好，渗透性强，提取率比水提法高， 缺点是提取产物的有效成分质量分数不高，造成后面纯化困难，且使用大量有机溶剂对环境有污染^[23]。

   热水提取：黄酮苷类物质易溶于水，所以对黄酮苷类含量较高的原料可以采用热水提取法。该方法虽然具有设备简单、生产成本低等优点，但提取杂质多，收率较低。并且由于水的极性大，易把蛋白质、糖类等溶于水的成分浸提出来，从而使提取液存放时，易腐败变质，为后续的分离带来困难^[24]，所以不常使用该方法提取黄酮。但如果直接用提取液作原料生产制剂或饮料等，因消耗溶剂的费用比其他方法低，仍为一种可取的提取方法。

   碱性条件下提取：黄酮类物质一般易溶于碱性溶液，酸化后又可沉淀析出。黄酮类物质是以2-苯基色原酮为母核的多羟基化合物，当在碱性条件下开环，形成2-羟基查耳酮，极性增大而溶解，当在酸性条件下，查耳酮又恢复了闭环结构，所以沉淀析出。主要用的碱性溶液是稀氢氧化钠和石灰水（氢氧化钙水溶液）。氢氧化钠水溶液的浸出能力高，但杂质较多，不利于纯化。石灰水可以使一些鞣质或水溶性杂质生成钙盐沉淀，有利于浸液纯化，但是浸出量不如氢氧化钠水溶液好，同时有些黄酮类化合物能与钙结合成不溶性物质，不被溶出。不同的原材料使用不同的碱性溶液^[25]。碱性提取时，所用碱的浓度不宜过高，以免在强碱条件下加热破坏黄酮类化合物的母核。丁利君等^[26]用pH值为10的氢氧化钠溶液从菊花中提取黄酮类物质时，效果较好。

   2.1.2双黄酮的提取

   双黄酮的来源一般是用有机溶剂从植物中提取或者通过合成^[27]获得的。本实验将使用有机溶剂浸取提取物获得双黄酮。

   钟郁青等^[28]用1Kg干燥银杏叶粉和3000ml乙醚，在热水浴中回流提取18h,最终得精制品2g。并通过实验得到在加热回流2h的情况下乙醚、乙酸乙酯、95%乙醇和甲醇等有机提取剂的提取效果大致相同。但甲醇和乙醇提取物杂质较多，乙醚提取效果最好的结果。

   2.1.3银杏酸的提取

   目前，银杏酸常用的提取方法有从银杏外种皮中提取银杏酸的方法很多，常用的提取方法有水提法、有机溶剂提取法、水提一树脂法、超临界C0₂提取法、细胞组织培养合成提取法、树脂提取法、酶提取法等。

   有机溶剂萃取：有机溶剂萃取利用化合物在两种互不相溶（或微溶）的溶剂中溶解度或分配系数的不同，使化合物从一种溶剂内转移到另外一种溶剂中。经过反复多次萃取，将绝大部分的化合物提取出来。可以通过银杏酸类化合物极性不同采用不同极性的有机溶剂进行萃取，达到分离银杏酸的目的。常用的提取溶剂主要有石油醚、甲醇、乙醇、正己烷、环己烷、氯仿等。姚建标^[29]对有机溶剂的提取条件进行了探讨：相对于极性溶剂，采用非极性溶剂直接提取，可以减少黄酮和多糖等水溶性和醇溶性杂质在粗提物中的含量。

   超声萃取法：超声波提取原理是将超声波产生的空化、振动、粉碎、搅拌等综合效应应用到中草药成分提取工艺中，实现击破细胞壁, 高效、快速提取细胞内容物的过程， 提取率较常规方法高。张蓉仙等^[30]分别利用超声萃取制备银杏外种皮石油醚提取物和热水浴回流制取水提取浸膏，结果表明超声萃取工艺制备粗提物杀灭钉螺效果要好于回流提取方法。

   超临界CO₂萃取法：超临界CO₂萃取分离过程的原理是利用超临界二氧化碳对某些特殊天然产物具有特殊溶解作用，利用超临界二氧化碳的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界二氧化碳溶解能力的影响而进行的。在超临界状态下，将超临界二氧化碳与待分离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来。当然，对应各压力范围所得到的萃取物不可能是单一的，但可以控制条件得到最佳比例的混合成分，然后借助减压、升温的方法使超临界流体变成普通气体，被萃取物质则完全或基本析出，从而达到分离提纯的目的，所以超临界流体二氧化碳萃取过程是由萃取和分离组合而成的。

   尹秀莲等^[31]对超临界CO₂萃取法从外种皮中萃取银杏酚酸工艺可行性进行了研究，确定了超临界CO₂萃取银杏酚酸的最佳条件，结果表明萃取压力为30 Mpa，温度45摄氏度，萃取时间6h，CO₂流量为2 L/min为最佳条件。此种方法萃取外种皮中的银杏酚酸比传统方法优越,表现在得率、纯度高，无溶剂残留，操作简便。

   2.1.4萜内酯的提取

   由于银杏叶中银杏萜内酯的含量极低(0.001%~0.8%),要得到银杏萜内酯具有高药用价值的GB和BB必须将银杏叶或其粗提物(GBE)进行提取,为银杏萜内酯单体的纯化创造条件。目前文献报道的银杏萜内酯的提取方法主要有溶剂萃取法、柱提取法及超临界提取法。

   有溶剂萃取法：浸提溶剂体系的选择是影响萜内酯含量的重要因素之一,浸提液应使萜内酯有大的溶解度。张立国^[32]等考察了黄酮和萜内酯在不同溶剂不同温度下的溶解性,结果表明:萜内酯在70℃,溶剂强度为8.50处溶解度最大,但在此溶剂体系中,黄酮苷的溶解度极小。王成章^[33]等比较了几种溶剂对银杏的浸提效果,认为25%乙醇水溶液的效果最好,因为BB和GC的极性较大,易溶于热水,而GA和GB极性较小,易溶于乙醇中,用25%的乙醇水溶液对白果内酯和二萜内酯的溶解度均较大,总内酯的提取率在95%以上。

   柱提取法:单纯采用柱提取而在后续步骤中不用溶剂萃取的,有李新岗^[34]等用Al₂O₃填充柱处理银杏叶的乙醇浸提液,然后用无水乙醇洗脱,洗脱液浓缩即得产品。方法可将银杏总内酯的含量提高到95%以上,得率为4.2%。但是,其白果内酯的含量较低,一种解释是白果内酯的水溶性较大,过柱后的母液中残存较多,有待于回收;另一种说法是Al₂O₃对白果内酯有降解^[35]作用。

   超临界提取法:超临界流体提取是一种新型的提取技术。游海等^[36]经乙醇提取后所得的乙醇浸液,除含有黄酮、内酯、银杏酚外,还含有大量的叶绿素、多糖、蛋白质和鞣质等物质,其中黄酮、内酯和多糖、蛋白质及鞣质等物质在超临界CO₂中的溶解度都极低,需很高压力才能溶解;而在乙醇存在下,银杏酚和叶绿素在较低压力就可溶解出来。可利用多糖和蛋白质不溶于高浓度乙醇的特点将这些大分子物质除去

   2.2银杏活性物质提取废液回收及条件优化

   如果用有机溶剂提法提取银杏叶中的活性物质，则在最后会产生较多的有机溶剂废液，具体可能有乙醇、乙酸乙酯、正丁醇和石油醚。一般可以通过其沸点和水溶性来蒸馏分开回收。

   	沸点/℃	密度/	相对分子质量/	溶解性
   乙醇	78.3	0.789	46.07	与水任意比互溶
   乙酸乙酯	77	0.902	88.11	水中溶解度为0.83g/L
   正丁醇	117.25	0.8098	74.12	微溶于水
   石油醚	30~80	0.64~0.66	——	不溶于水

   蒸馏：蒸馏是一种热力学的分离工艺，它利用混合液体或液-固体系中各组分沸点不同，使低沸点组分蒸发，再冷凝以分离整个组分的单元操作过程，是蒸发和冷凝两种操作的联合。。蒸馏可将易挥发和不易挥发的物质分离开来，也可将沸点不同的液体混合物分离开来。但液体混合物各组分的沸点必须相差很大（30℃左右）才能得到较好的分离效果。

   分馏：分馏是分离几种不同沸点的混合物的一种方法；对某一混合物进行加热，针对混合物中各成分的不同沸点进行冷却分离成相对纯净的单一物质过程。过程中没有新物质生成，只是将原来的物质分离，属于物理变化。

   分馏实际上是多次蒸馏，它更适合于分离提纯沸点相差不大的液体有机混合物。如煤焦油的分馏；石油的分馏。当物质的沸点十分接近时，约相差20℃，则无法使用简单蒸馏法,可改用分馏法。分馏柱的小柱可提供一个大表面积与蒸气凝结。混合物先在最低沸点下蒸馏,直到蒸气温度上升前将蒸馏液作为一种成分加以收集。蒸气温度的上升表示混合物中的次一个较高沸点成分开始蒸馏。然后将这一组分分开收集。

   精馏：精馏一种利用回流使液体混合物得到高纯度分离的蒸馏方法，是工业上应用最广的液体混合物分离操作，精馏之所以能使液体混合物得到较完全的分离，关键在于回流的应用。回流包括塔顶高浓度易挥发组分液体和塔底高浓度难挥发组分蒸气两者返回塔中。汽液回流形成了逆流接触的汽液两相，从而在塔的两端分别得到相当纯净的单组分产品。塔顶回流入塔的液体量与塔顶产品量之比，称为回流比，它是精馏操作的一个重要控制参数，它的变化影响精馏操作的分离效果和能耗。

   减压蒸馏：液体的沸点，是指它的饱和蒸气压等于外界压力时的温度，因此液体的沸点是随外界压力的变化而变化的，如果借助于真空泵降低系统内压力，就可以降低液体的沸点，这便是减压蒸馏操作的理论依据。 减压蒸馏是分离和提纯有机化合物的常用方法之一，它特别适用于那些在常压蒸馏时未达沸点即已受热分解、氧化或聚合的物质以及沸点较高的物质。

   2.2.1石油醚的回收

   在实验过程中使用的石油醚沸点在30~60℃，与其他组分的沸点相差较大，可以直接用蒸馏的操作来达到分离回收的目的。

   2.2.2乙醇的回收

   乙醇和乙酸乙酯的沸点接近，但是与其它组分的沸点相差较大，所以可以直接用蒸馏使乙酸乙酯和乙醇一起回收，再利用二者水溶性的差异，加入去离子水，通过分液操作使乙酸乙酯分离，然后将乙醇水溶液进行蒸馏操作即可。

   2.2.3乙酸乙酯的回收

   乙酸乙酯的回收操作一般是与乙醇一同蒸馏出来，然后利用二者水溶性差异进行萃取分液，上层有机相即为乙酸乙酯。

   2.2.4正丁醇的回收

   正丁醇的沸点高于其它的组分许多，所以进行蒸馏之后剩余的物质即为正丁醇。

   2.3银杏叶活性物质提取绿色工艺及条件优化

   2.3.1 实验原始材料的处理

   以实验室的干银杏叶为原料，机械粉碎粉末至40目以下。

   2.3.2实验活性物质的提取

   取样品300g（以前为200g）加入2.0L无水乙醇，在60℃下至少搅拌1个小时，固液分离，收集提取液。因为溶剂量比较大总共有2L左右，先要用滤布初步过滤，除掉其中的滤渣，滤渣颜色为黑绿色，得到的初步过滤的溶剂后在用布氏漏斗进行抽滤从而达到再次达到除掉滤渣的作用。残渣重复处理两次。三次提取液合并，旋蒸至得到银杏提取物浸膏，称重。

   2.3.3 初步除杂（主要除掉其中的糖类和蛋白质）

   所得浸膏加10倍质量的水分散，加入与水等体积的乙酸乙酯—丁醇混合剂（1:1）萃取，分离有机相，在重复两次。三次萃取液合并，旋蒸至得到的活性物质混合物（包括内酯、黄酮苷、双黄酮、银杏酸），称重。

   2.3.4活性物质分离（需改进）

   上一步得到的活性物质混合物再次分散于5倍质量的水中，加等量体积石油醚萃取，离心分离，分别取出水层、油层和沉淀。沉淀重复上述处理两次。

   水层为内酯与黄酮苷混合物。收集后用大孔树脂纯化（装样后，先用水冲出多糖，再用50％乙醇冲）收集乙醇溶剂。

   石油醚层为银杏酸。沉淀为双黄酮，收集后纯乙醇溶解抽滤，蒸干后称重。

   注意事项：水层、油层和沉淀很难分离，故先离心，分取上层石油醚后，用滴管吸取下层水，布氏漏斗抽滤。水层略带浑浊。

   纯化步骤：大孔树脂先用酒精或乙醇冲洗干净再用蒸馏水将乙醇冲出使得装样前柱子里的溶剂是水；将收集水层装入柱子再用蒸馏水冲洗至流出液为无色或略带淡黄色；再用50％乙醇冲洗至流出液由黄色转为无色或淡黄色，收集乙醇溶剂蒸干得纯化后的产品。

   3. 研究计划与安排

   3.进度安排

   第1-3周	第3-6周	第6-15周	第15-16周	第16周
   开题报告查阅相关文献，了解课题背景、概念及研究进展。拟定研究方案，完成开题报告	ppt讲解及论证研究方案	根据试验方案进行实验，探讨实验结果，得出结论	完成并修改毕业论文	准备论文答辩

   4. 参考文献（12篇以上）

   参考文献

   [1].全国中草药汇编(上册) 801页

   [2].徐艳芬, 张丽娟, 宋新波. 银杏叶提取物的研究进展 [j]. 药物评价研究, 2010, 33(6): 452-456.

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