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LC-MSMS检测大鼠血浆益母草苷浓度的方法学研究毕业论文

 2022-04-19 06:04  

论文总字数:21881字

摘 要

为了检测大鼠血浆益母草苷方法学的研究,创建了简单、灵敏的高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)。通过一个简单的甲醇沉淀蛋白(含0.05 %甲酸)制备大鼠血浆样品,采用Hypersil GOLD AQ C18反相柱, (150mm × 2.1 mm, 5μm, Thermo, USA)进行色谱分离,使用的流动相由乙腈和5mM醋酸铵。用三重四极杆串联质谱仪的多重反应监测(MRM)模式下进行离子的检测。益母草苷的检测离子对为m/z366.5→151.1,内标的检测离子对为m/z530.3→183.1。该方法的线性关系浓度范围为1-1000 ng/mL的益母草苷。益母草苷的定量下限(LLOQ)为1ng/ ml。准确度用相对误差表示在−5.60% 和0.85%之间。日内和日间精密度范围为0.81%~12.61%,益母草苷的提取回收率ER超过70%,相对基质效应ME为从85.91%至91.23%。该方法成功应用于检测在大鼠静脉给药后益母草苷的药动学特征。采集的数据将有助于进一步的研究环烯醚萜类活性成分在中药的临床应用(TCM)。

关键词:益母草苷 LC-MS/MS 药代动力学 绝对生物利用度

Study on the detection of LC-MS/MS in rat plasma leonuride methodology

Abstract

A simple and sensitive high-performance liquid chromatography–electro-spray ionization tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method was developed and validated to determine leonuride in rat plasma.Biological samples were prepared by a simple protein precipitation with methanol (containing 0.05% formic acid). The analytes were separated by a C 18 reversed phase column and detected with a triple quadrupole tandem mass spectrometer in the multiple-reaction monitoring (MRM) mode to monitor the precursor-to-product ion transitions of m/z 366.5 → 151.1 for leonuride l and m/z 530.3 → 183.1 for Picroside-II (IS) in positive ionization.Good linearity of each calibration curve was produced over the concentration range of 1–1000 ng/mL.The lower limit of quantification (LLOQ) was 1 ng/mL for the leonuride.This method was successfully applied to the pharmacokinetic and tissue distribution studies of leonuride in rat.The accuracy values were between−5.60% and−0.85% relative error. Intra-day and inter-day precision of leonuride in plasma ranged from 0.81% to 12.61% (RSD).The extraction recovery of leonuride was more than 70%, and the relative matrix effect ranges from 85.91% to 91.23%. The validated method has been successfully applied to determine the pharmacokinetic profile of leonuride in rat plasma following oral and intravenous administration.The acquired data would be helpful for the clinical application and further studies of Traditional Chinese Medicines (TCM) with active ingredients of Iridoid Glycosides.

Keywords: leonuride;LC-MS/MS;Pharmacokinetics;Absolute bioavailability

目 录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 益母草 1

1.1.1益母草简介 1

1.1.2益母草功效作用 1

1.1.3 益母草的研究方法 2

1.1.4 益母草苷的基本性质 3

1.2方法学 3

1.2.1 生物样本分析方法的建立和确证 3

1.2.2 方法学确证(Method Validation) 3

1.3益母草苷的生物利用度(BA)与生物等效性(BE) 4

1.3.1生物利用度 4

1.3.2 生物等效性 5

1.3.3生物利用度的评定 5

1.3.4生物利用度的计算 5

第二章 实验部分 6

2.1材料与仪器 6

2.1.1主要试剂 6

2.1.2主要仪器 6

2.2标准溶液和质量控制(QC)样本的制备 6

2.3样品的制备 7

2.4仪器和LC-MS/MS分析条件 7

2.5方法学验证 9

2.5.1特异性 9

2.5.2线性和最低定量限(LLOQ) 9

2.5.3提取回收率和基质效应 10

2.5.4日内和日间的精密度和准确度 10

2.5.5稳定性和稀释 10

2.5.6残留效应 11

2.6药代动力学研究 11

2.7组织分布研究 11

2.8数据分析 11

第三章 结果与讨论 13

3.1质谱和色谱条件的优化 13

3.2血浆样品预处理 13

3.3方法学验证 13

3.3.1特异性 13

3.3.2标准曲线和LLOQ 16

3.3.3提取回收率和基质效应 17

3.3.4日内和日间的精密度和准确度 18

3.3.5稳定性和稀释 18

3.3.6残留效应 19

3.4药代动力学的应用 19

3.5组织分布研究 20

第四章 结论 22

参考文献 23

致谢 27

文献综述

1.1 益母草

1.1.1益母草简介

益母草最早是记录在 《神农本草经》中的,后来在中国药典中也有出现,并广泛应用在中医(TCM)中[1]。它是唇形科植物益母草 Leonurus ,是夏天开花一年或二年生的植物。其在全国许多地区都有分布。益母草含有脂肪酸类、生物碱类、二萜类等化合物,它广泛应用在中药成方制剂,例如益母草膏、益母草注射液、益母草颗粒等。在临床上用于治疗痛经、心肌缺血、高黏血症等疾病,益母草中的化合物是治疗妇科疾病的重要药物。草有很强的药理活性,如果对它的药效学物质进行深入的研究,将会有重大意义。益母草还广泛分布于其他地区,如亚洲、欧洲、美洲和非洲,同样作为传统医学的一个草本来应用[2]。最近几十年以来,药学研究者对于各地益母草中的各个生物碱含量进行了深入研究[3-6],它具有许多显著的影响包括活化血流量、调节月经紊乱、化瘀生新组织,促进尿液排泄,消除肿胀,所以被广泛用于治疗月经不调、乳房疼痛、产后瘀血,以及其他妇科疾病[7]。益母草化学成分研究表明含有多种活性成分,主要含有黄酮、脂肪酸、萜类和生物碱等[8]。现代研究发现,其生物碱中两种成分水苏碱和益母草碱已作为益母草治疗疾病的有效成分[9-11],它的生物活性成分在体内和体外药物药理学试验有显著作用。

1.1.2益母草功效作用

(1)对子宫的作用: 实验表明其对猫,兔子等动物离体子宫具有刺激兴奋的作用。

(2)抗血小板聚集作用和抗血栓的形成:在体外的实验表明, 益母草的提取物具有抑制A动物血小板聚集的作用。体内实验也证明了益母草能明显降低外周循环中血小板的总数 和肺泡壁上血小板及其聚集物,并且益母草还具有提高机体细胞免疫等作用。

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