1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

核苷是含氮碱基与糖组分缩合成的糖苷[1]。核苷中的戊糖有核糖和脱氧核糖两种，常见碱基有胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤。核苷类似物是由核糖或脱氧核糖在其c1位连一个碱基（嘌呤或嘧啶）后形成的一系列化合物统称[2]。由于碱基和戊糖存在着多种结构修饰，所以核苷类似物种类繁多。核苷类似物可以作为食品和保健品的添加剂；目前我国食品添加剂使用标准gb 2760-2011允许使用的呈味核苷酸包括：5#8217;-呈味核苷酸二钠(i g)，5#8217;-肌苷酸二钠（imp）和5#8217;-鸟苷酸二钠（gmp）三种，这三种被称为食品增味剂。更为重要的是，还可作为药物治疗艾滋病、肿瘤、心血管等多方面的疾病。在目前的抗病毒药物中，核苷类似物占到一半以上，主要是病毒复制过程中酶的抑制剂。众所周知，核苷在细胞生命中占有极为重要的地位，可以用与天然核苷结构类似的改造核苷干扰肿瘤细胞的生长和病毒的繁殖，通过抑制病毒dna 多聚酶和逆转录酶的活性并与核苷酸竞争性掺入病毒 dna 键，从而终止或抑制病毒dna链的延长和合成，使病毒的复制受到抑制而发挥抗病毒作用。在抗肿瘤药物中，核苷类似物占到了市场五分之一的份额，核苷类似物利用生物电子等排原理，对嘌呤核苷、嘧啶核苷的结构进行化学修饰，经细胞内三磷酸化后，通过抑制脱氧核苷三磷酸的合成、掺入dna或rna分子中干扰细胞复制、竞争性抑制dna聚合酶作用，特异性干扰核酸的代谢，阻止细胞的分裂和繁殖，最终导致肿瘤细胞死亡。现有不少核苷类药物已应用于临床，如：齐多夫定、扎西他滨、克拉屈滨、拉米夫定、阿巴卡韦、氟达拉滨、阿洛夫定等[3,4,5,6]。

目前合成核苷类似物主要有三种方法：化学法、发酵法、酶法。[7,8]化学合成法有多种途径，缺点是步骤多、反应条件苛刻；所用试剂昂贵并有一定毒性，生产成本高且收率低。发酵法是利用微生物培养使其在培养基中积累核苷，这个方法周期长，易染菌，收率低，将dna酶解后，分离4种脱氧核苷，分离工程繁杂，成本高。而且这种方法目前还只限于几种天然核苷，对于脱氧核苷和一些修饰核苷无能为力。酶法生物合成则具有专一性强、原料易得、操作简单、反应时间短、反应条件温和、不易染菌、产率高等特点。

到目前为止，绝大多数的核苷类似物通过化学方法合成。较为经典的方法就是采用碱基与核糖进行缩合，得到α、β同分异构体，然后去掉保护基团后，再进行分离；也可以以天然的核苷为原料，对其碱基或核糖基进行修饰。但化学法操作复杂，反应繁多，需要对碱基或核糖基上的活性基团进行修饰保护，并且最终的转化率不高，产物成分复杂，一般得到的是α、β同分异构体，还需要对其拆分才能得到有活性的β型核苷，因此分离纯化难度大[9]。而且使用到大量有毒有害试剂，给环境带来了严重的污染。

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

本课题主要是构建嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶的融合蛋白，并实现其可溶性表达。实验内容:

1.融合蛋白linker的选择，以及引物的设计。

2.融合蛋白表达菌株的构建以及表达。