1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

癌症已经成为全球威胁人类健康的首要疾病之一，2010年美国癌症协会(american cancer society,简称acs)统计显示，发达国家癌症紧随心血管疾病位居死亡率第二位，以美国为例，每天新发4190癌症病例。新发癌症中，全美每天死亡人数达1560人^[1]。世界卫生组织报告显示，2010年全世界约有1270万癌症新增患者，760万死于癌症，尤其在发展中国家，每年癌症新增例数达56%，据推测到2020年前，全球癌症发病率将增加50%，即每年将新增1500万癌症患者。癌症的死亡人数也在全球迅猛上升，2030年这个数字可能会增至1700万^[2]。迄今为止，临床针对癌症患者的治疗除了外科手术治疗、放射治疗外，化疗依然是治疗肿瘤患者最有效的方法。在化疗药物的选择中，作用于靶向微管动态平衡的抗有丝分裂药物是目前临床实体肿瘤治疗的首选药物之一。根据对微管蛋白作用方式，紫杉醇属于促进微管聚合的紫杉烷类药物^[3]。紫杉醇 (paclitaxel) 是1963年美国化学家瓦尼(m.c. wani)和沃尔(monre e. wall)首次从一种生长在美国西部大森林中称谓太平洋杉（pacific yew）树皮和木材中分离所得。在筛选实验中，wani和 wall发现此紫杉醇粗提物对离体培养的鼠肿瘤细胞有很高的杀伤活性。 1971年，他们同杜克（duke）大学的化学教授姆克法尔(andre t. mcphail)合作，通过x-射线分析确定了该活性成份的化学结构#8212;#8212;一种四环二萜化合物，并把它命名为紫杉醇(taxol)。 紫杉醇分子式(c47h51no14)分子量(853.92)。紫杉醇主要通过与肿瘤细胞微管蛋白β结合^[4]，促进微管聚合抑制微管解聚，使肿瘤细胞阻滞于g2/m期，诱发肿瘤细胞凋亡或坏死而达到抗肿瘤的效果^[5]。紫杉醇于1992年被美国fda批准用于治疗复发的和难治的乳腺癌和卵巢癌，以及肺癌和头颈部肿瘤^[6]。尽管紫杉醇临床治疗中已获得巨大成功，但临床使用过程中亦发现一些缺点亟需克服。其一是紫杉醇的水溶性差，需要用蓖麻油作为助溶剂，这样就增加了紫杉醇使用时带来的不良反应，不良反应主要表现为骨髓抑制、心脏毒性、神经毒性、肾毒性、全身变态反应、血管损害、毛发脱落等^[7]。其二是易产生严重的耐药现象，紫杉醇所作用的靶点微管蛋白不仅是构成细胞骨架和纺锤体的主要成分，同时也参与细胞有丝分裂、细胞器组成与运输及信号传导等,因此微管蛋白变化可导致与药物相互作用的改变而引起耐药产生^[8],主要表现为对某些肿瘤及继发性耐药肿瘤病人的化疗无效^[9]。因此开发和筛选具有潜在抗肿瘤细胞活性的紫杉醇衍生物有很大的意义。

mtt法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等，其优点是灵敏度高、经济。mtt法其原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性mtt还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能^[10]。二甲基亚砜(dmso)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490_nm（肿瘤细胞的活力检测一般选570或630_nm，测定波长的选择是因显色溶液而异的）波长处测定其光吸收值^[11]，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，mtt结晶形成的量与细胞数成正比，定量检测细胞增殖和生长。在进行mtt试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以防止细胞过满。这样，才能保证mtt结晶形成的量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异^[12]。本实验的mtt检测法将使用96孔板^[13]。对样本量进行设计，细胞数量因实验目的不同应做相应调整，给药的剂量一般设定5-7个浓度梯度，每个浓度选用3-6个副孔。还应设置空白对照孔^[14]。通过mtt法测量出有关数据，并对数据进行处理。如通过酶标仪检测后腰进行数据处理，计算其ic₅₀值，一般方法

(lgic₅₀= x_m-i(p-(3-p_m-p_n)/4)

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

将卵巢癌细胞a2780进行复苏，细胞复苏后, 加入10倍以上培养液, 混匀后低速离心, 除去上清液, 重复1次后, 加入10mlrpm i- 1640培养液, 放入培养箱培养^[16]。mtt法筛选具有抗卵巢癌细胞a2780活性的紫杉醇衍生物的准备工作，进行预实验，检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数(s)和培养时间(t)，以防止细胞过满，保证mtt结晶形成的量与细胞数呈的线性关系。对给药剂量设定浓度梯度，每个浓度选用副孔数进行设计，并设置空白对照孔。取对数生长期的卵巢癌细胞，用0.125% trypsin/0.01edta消化后，以含10% 小牛血清的dmem培养液调整细胞浓度，以(s)数量细胞接种于孔板培养板，孵育8小时后加入不同稀释浓度的紫杉醇衍生物2μl，使其终浓度分别为各所需浓度(1~100μmol/l)，对照组加等体积的溶剂。每个浓度均设4个复孔(重复3次)，置37℃、5% co₂孵箱中连续培养48 小时。培养结束前2小时各孔加入mtt（5mg/ml）20μl，放置孵箱中继续孵育4小时，弃上清，每孔加入dmso 150μl，充分振荡混匀后，用酶联免疫检测仪在570nm处测定各孔的吸光度（用od值表示），计算抑制率与半数抑制浓度，通过抑制率可以筛选出具有抗卵巢癌细胞活性的紫杉醇衍生物，并通过半数抑制浓度可以考察不同类型紫杉醇衍生物抗卵巢癌细胞活性的药效情况，为新型紫杉醇累抗癌药的开发做好准备。

参考文献: