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白介素21在大肠杆菌中的可溶性表达开题报告

 2020-06-11 08:06  

1. 研究目的与意义(文献综述包含参考文献)

题目:白介素21在大肠杆菌中的可溶性表达

选题意义:研究动物蛋白以及结构蛋白的重组表达在生物医学以及生物制药领域有着重要意义。尽管可选择克隆表达的宿主有许多,但是作为一个传统而经典的适于蛋白质过量表达的宿主,大肠杆菌有着操作简单,成本低,遗传背景清晰等优势。第一个人来源的重组蛋白生长激素抑制剂是在大肠杆菌中表达,第一个投入市场的重组药物蛋白胰岛素(1982年获得了美国FDA认证)也是在大肠杆菌中表达。自此以后,许多重组药物蛋白在大肠杆菌中合成并被人们使用,其中包括溶栓剂,激素,生长因子,干扰素以及一些抗体片段。现在接近30%市场上的重组生物产品是在大肠杆菌中生产的。可见,大肠杆菌是生产动物蛋白药物蛋白使用广泛的宿主。

大肠杆菌周质空间具有优越的特点使得大肠杆菌有着独特高效的表达机制:大肠杆菌有内膜和外膜组成的双层膜结构, 在内膜和外膜之间的区域即所谓的周质(periplasmic space) 。 利用大肠杆菌系统, 在外源基因的 N 端融合一段细菌蛋白的疏水信号肽, 可将目的蛋白运送到周质空间, 经信号肽酶将信号肽切除后, 即可获得与天然蛋白一致的构象(不含 N 端多余的甲硫氨酸)。E .coli 的细胞周质中含有一系列的酶, 并提供了一个氧化的环境, 这些都有利于二硫键的正确形成, 促进蛋白的正确折叠, 使有活性药物蛋白的产量得到提高。 另外, 周质空间的蛋白含量低, 蛋白酶活性要比胞质中低, 使所表达的蛋白能避免胞内降解从而稳定地存在 , 有利于目标蛋白的浓缩。对周质分泌型菌体采用定向释放技术, 使细胞外膜破损而不损害细胞内膜, 定向释放周质空间的蛋白质, 从而使下游纯化简单有效, 使来自宿主菌的污染减小到最低。

大肠杆菌表达体系有着以上不小的优势,但是实现高效表达仍存在以下问题:1、由于蛋白质的毒性以及密码子偏好性而低表达或是不表达。2、蛋白质折叠不完全或cDNA突变引起的蛋白无活性。3、蛋白质不正确折叠或未形成正确的二硫键而形成包涵体:实现蛋白的可溶性表达是解决大肠杆菌表达系统缺陷的关键。提高可溶性表达的策略有许多。一是共表达分子伴侣,分子伴侣在是蛋白质获得天然结构的重要蛋白,分子伴侣通常帮助未折叠的新生蛋白正确折叠,也有些分子伴侣如ClpB可以解开包涵体中错误折叠的蛋白。共表达单个或系列分子伴侣能够实现蛋白的可溶性表达[7]。二是降低蛋白质的合成速率。降低蛋白质的合成速率使得新生多肽有足够的时间正确折叠。降低蛋白质合成速率的常用方法是降低诱导温度,对于易形成包涵体的蛋白质表达温度适宜15-25℃。过低的温度会导致慢的生长速率和低蛋白产量。另外,诱导条件(诱导剂的种类、浓度),载体和宿主的选择也会影响蛋白质的合成速率。某些高度可溶的蛋白质与其它易形成包涵体的蛋白融合后可以促进融合蛋白质可溶性表达,具有这样功能的蛋白有麦芽糖结合蛋白(MBP),谷胱甘肽S-转移酶(GST),硫氧还蛋白A(TrxA),蛋白二硫键折叠异构酶(DsbA),转录终止抗终止因子(NusA)等(表1-1)。谷胱甘肽S-转移酶和麦芽糖结合蛋白是发展最早的増溶性融合标签,也是兼有增溶和方便纯化双重优势的标签。 Smith等[1]和Duplay等[2]分别用GST和MBP融合重组蛋白实现了可溶性表达并使用亲和层析进行一步纯化。后续研究显示GST增加重组蛋白溶解性能力有限,而不溶性的蛋白融合MBP后常以可溶形式表达[3, 4]。有平行比较表示多数情况下MBP增加重组蛋白溶解性能力是最强,而2009年发现的融合标签NusA与MBP具有相当的増溶性性能力。也有研究者证明TrxA也具有相当的増溶性的能力[5, 6]。另外,DsbA对于一些含有二硫键的蛋白具有很好的作用[7]。通过静电排斥而具有增溶作用的超酸性融合标签(yjgD,rpoD和msyB)同时能作为分子内伴侣辅助蛋白质正确折叠,从而增加了易发生聚集的牛肠激酶,烟草腐蚀病毒蛋白酶等蛋白的可溶性表达[3]。另一值得注意的融合标签是大肠杆菌的磷酸甘油酸酯激酶N域,易发生聚集的乘客蛋白使用该标签后可溶性表达量增加,切除该标签后目的蛋白仍表现出增强的可溶性[8]。新开发的融合标签如Fh8是一个高效的増溶性标签,具有増溶性和纯化双重特点,该标签分子大小仅为8kDa,该标签可以提高绿色荧光蛋白GFP和超氧化物歧化酶SOD的可溶性表达,并可使用依赖钙作用的疏水树脂纯化[10]。HaloTag除了提高融合蛋白的可溶性表达,也能特异性结合固定有合成配体层析柱,使用亲和层析纯化,相比于MBP和GST更好地增加23种人类蛋白的可溶性,获得74%的可溶性蛋白[11]。融合EspA标签表达切除标签后能够获得有抗肿瘤活力的白介素24,并使用螯合EspA单克隆抗体的琼脂糖柱亲和纯化[12]

白介素 21( IL-21) 是一种Ⅰ类细胞因子家族的新成员,主要由活化的 CD4T 细胞产生,靶向结合于含特异性白介素 21 受体( IL-21R) 和通用 γ 链亚单位的复合型受体链[13。IL-21 广泛地表达于免疫与非免疫细胞中,它的表达可以由细胞的活化和/或分化状态来调节。它通过与 IL-21R 的结合刺激 JAK-1 和 3/Stat 级联信号途径的活化; IL-21 也能够活化磷脂酰肌醇 3 激酶/AKT 信号通路以及 MAPK 家族成员如上皮细胞、肿瘤细胞和单核细胞中的胞外信号调节蛋白激酶 1/214]。IL-21 通过直接与这些信号途径的活化相关联,从而具有广泛的生物学功能,主要表现为免疫调节功能,其中最显著的特征是能增强效应 T 细胞及活化的 NK 细胞的功能15,显著地调节 B 细胞、CD4 T 细胞的活性。IL-21 和IL-21R 对调节巨噬细胞和滑膜细胞的活性也具有重要作用。如 IL-21 促进 T 细胞和 NK 细胞的增殖和细胞溶解活性; 介导由 T 细胞、NK 细胞、巨噬细胞和滑膜细胞分泌的细胞因子、趋化因子的表达。白介素21具有以下生物学功能:1.在人类原始的B细胞,白介素21可增强抗CD40介导的增殖而抑制抗免疫球蛋白M和白介素4的增殖,白介素21诱导CD40活化的B细胞凋亡的同时,也促使其增殖反应。2.白介素21是作用于B细胞的一类免疫抑制因子,可以抑制B细胞淋巴瘤细胞亚群的增殖,白介素21也可能在调节B细胞肿瘤发生方面具有作用。3.白介素21R在幼稚和激活的NK细胞都有表达,白介素21有调节NK细胞的增殖和功能的作用。4.T淋巴细胞白介素21来源于激活的CD4 尤其是Th2效应细胞,在CD4 和CF8 T细胞亚群,都可检测白介素21R的表达。5.IBD是近年来在我国和欧美诸国极为普遍的一种自身免疫性疾病,IBD包括溃疡性结肠炎和克罗恩病,以肠道炎症和肠粘膜损伤为主要特征。免疫紊乱在IBD发生发展中起着重要作用,多种细胞因子的变化与IBD有关,白介素21是新近发现的一种细胞因子,是与众多细胞因子紧密相关的核心因子

利用大肠杆菌,使白介素21这种具有特殊用途的重组蛋白进行可溶性表达就是本次课题的目标。拟采用融合标签的手段实现课题目标,融合标签是大规模生产可溶性蛋白质的有效工具,融合标签的开发和利用使融合标签技术不仅局限用于蛋白质的纯化和检测,而且在提高重组蛋白质的可溶性表达中得到广泛应用。融合标签能增加重组蛋白表达量或在蛋白质折叠过程起作用,增强重组蛋白质的可溶性表达。这些融合标签大多是蛋白质,仅有少数是多肽片段。研究表明某些高度可溶的蛋白质在与其它易形成包涵体的蛋白质融合后会促进融合蛋白质以可溶形式表达,查清融合标签增强蛋白质可溶性表达的机理和增强重组蛋白的溶解性是融合标签的发展方向和目的。对于本次试验所采用的可溶性标签还需要具体试验进行具体处理,如果单个融合标签难以满足实验技术的要求,那么组合标签技术也是一个不错的选择,融合标签可能会使蛋白质的结构和性质上产生某种不可预知的变化,因此,切除标签对保证蛋白质的性质是必要的。融合标签技术的发展为可溶性蛋白质的生产包括一些难以表达的蛋白药物表达提供了便利,许多融合标签系统已作为实现可溶性表达和纯化的常用方法,所以本实验才采取融合标签的方法来实现白介素21在大肠杆菌中的可溶性表达。

参考文献

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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

研究方法

(1)融合标签体系载体的构建

主要有两个方法:1、采用重叠pcr的方法将标签融合至目的蛋白的n端;2、通过构建了ffase截短体融合标签的载体,将目的蛋白pcr后,经双酶切连接,插入自行构建的表达载体。

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