文 献 综 述

（1）背景介绍

磷是生物重要的营养元素之一。磷是原生质的重要组分，高能磷酸键是能量的载体。植物的光合作用和体内的生化过程都必须有磷参加。大气中没有磷素的气态化合物，因此土壤磷素的循环与碳、氮、硫等元素的循环不一样，没有大气阶段。它是一种典型的沉积循环，主要在土壤、植物和微生物之间进行。土壤中的磷素是以无机和有机化合物这两种状态存在。土壤中无机磷的含量约占全磷量的1/2~1/3土壤中无机磷的形态主要有原生矿物和次生矿物二种类型。原生矿物主要有磷灰石，其主要成分为钙氟磷灰石和氟氧磷灰石。次生矿物主要指化合态即沉淀态的磷酸盐，它可分为闭蓄态和非闭蓄态二种类型。闭蓄态磷指磷酸铁和磷酸铝被氧化铁胶膜所包蔽，其活性低，供磷能力弱。非闭蓄态磷酸盐包括磷酸铁、磷酸铝、磷酸三钙三种形态。这三种形态的磷在一定条件下可以释放出来，供植物利用^[1]。根据报道，我国约75%的耕地土壤缺磷。土壤中95%的磷以无效态形式存在，植物难以直接利用。土壤中平均含磷量约0.12%，而其在土壤溶液中的含量仅为0.005#8212;1.0mg/kg。作物当季磷肥利用率仅为5%#8212;10%，大部分磷作为无效态在土壤中累积。由于长期施用磷肥，土壤磷库充足而磷流不足是目前耕地土壤的现状。土壤很多因素影响磷的利用，其中微生物对磷的有效化影响很大^[8]。事实上土壤中存在大量的解磷微生物，能够将无效态磷转化为可溶性磷^[2]。具有解磷作用的微生物种类很多，也比较复杂。有人根据解磷菌分解底物的不同将它们划分为能够溶解有机磷的有机磷微生物和能够溶解无机磷的无机磷微生物，实际上很难将它们区分开来。目前报道具有解磷作用的微生物解磷细菌类有芽孢杆菌、欧文氏菌、土壤杆菌、沙雷氏菌、硫杆菌、埃希氏菌；解磷真菌类有青霉菌、曲霉菌、根霉菌、；放线菌有链霉菌；AM 菌根菌。

尽管土壤中富含多种以有机磷或无机磷形式存在的磷，但是，由于磷可利用率低，磷素仍然是限制植物生长的主要营养元素之一。解磷微生物在土壤中普遍存在，能以环保而可持续的方式为植物生长提供更多的有效磷。许多微生物在实验室条件下表现出良好的溶解磷化合物的能力，但是在农业生产的大规模应用中可行性较低，或不能表现出明显的增产效果。究其原因，可能是因为实验室简单的筛选条件，使筛选出的微生物不能适应于复杂的土壤环境；或者是微生物自身对不同的土壤环境适应性和耐受性较差，影响其解磷能力的发挥；同时，有些细菌的解磷能力具有遗传不稳定性，可能随多次传代而丧失。因此，筛选更多新型的解磷能力强、环境适应性好、遗传稳定性高的菌株，对解磷微生物的推广应用和丰富解磷微生物菌种库具有重要意义^[6]。此外，微生物解磷的生物化学与分子机制尚待深入研究。从分子生物学水平解析微生物溶磷机理，将溶磷基因克隆到能适应土壤环境的其他微生物中，能为提高解磷微生物的应用价值提供理论依据和新的技术思路。

(2)国内外研究进展

解磷菌的解磷机制因不同的菌株而有所不同。有机磷微生物在土壤缺磷的情况下，向外分泌植酸酶、核酸酶和磷酸酶等，水解有机磷，转化为无机磷酸盐。无机磷微生物的解磷机制一般认为与微生物产生有机酸有关，这些有机酸能够降低 p H 值，与铁、铝、钙、镁等离子结合，从而使难溶性的磷酸盐溶解^[4]。除了有机酸酸解作用、磷酸酶酶解作用和质子释放产生的酸化作用机制外，其他可能的解磷机制还有：（1）硫细菌产生的硫化氢与磷酸铁等发生化学反应，使磷酸盐溶解。（2）某些微生物分解动植物残体时产生腐殖酸、胡敏酸、富马酸等能螯合铁、铝、钙、镁等离子，进而能将磷酸根离子释放出来，而且腐殖酸也能与铁、铝磷酸盐形成可溶性复合物，被植物吸收利用。（3）Ca2 以草酸盐等形式在微生物体内积聚或被微生物吸收，使磷酸根离子释放出来^[5]。

除了解磷微生物的遗传特性差异，磷化合物的溶解还取决于多种物理化学的因素，如土壤中磷素的种类和含量、酸浓度、温度、土壤成分的特点等。碳、氮营养通过影响细胞增殖和有机酸产生过程，也能影响微生物对土壤中磷素的溶解。许多学者通过对解磷菌株在多种碳氮源下的解磷能力进行测定，考察了能量来源对微生物解磷效应影响的大小，并寻找最优碳氮源。此外，同一种微生物在同样的营养条件下对不同种类磷源的溶解情况也有很大的差异，常用于对比试验的磷源有 Ca-P、Al-P、Fe-P 等形式的难溶磷酸盐以及各种不同来源的磷矿粉^[14]。

解磷微生物对植物生长的促进作用，主要是基于其对土壤中难溶磷化合物的溶解，增加土壤中可利用磷的含量，以及促进植物对有效磷的吸收，增加作物产量。但研究表明，解磷微生物的增产作用随土壤中原有的有效磷水平而不同，有效磷低的土壤上增产幅度大于有效磷高的土壤。一些解磷菌株，如芽孢杆菌属、假单孢菌属的某些菌株，能分泌生长素、赤霉素、细胞分裂素等植物生长调节因子，刺激作物的生长。解磷微生物在溶解植物根际难溶磷化合物的同时，也有利于植物对N、K、Ca、Mg、Fe、Zn 等其他营养元素的吸收，促进植物的生长。植物根际解磷微生物的大量生长繁殖，能与一些病原微生物的生长形成竞争，限制其生长繁殖，有的解磷菌还对病原微生物具有拮抗作用，抑制病原微生物的生长^[13]。部分解磷微生物还能分泌抗生素类物质，抑制或杀死病原真菌或细菌。解磷微生物在促进植物生长的同时也增强了植物对环境胁迫的抗性。如 VA 菌根可促进植物对 P 的吸收利用，从而促进植物根系的生长，增强抗寒、抗旱能力。另外，VA 菌根真菌菌丝体的生长扩大了根圈面积，增大植物根系与土壤的接触面积，使得植物根系对土壤养分和水分吸收利用的范围扩大，从而提高植物抗逆性^[12]。

解磷菌株的分子生物学鉴定。解磷菌核糖体的RNA含有3种类型，即23 srRNA、16 S rRNA和5 S rRNA，它们含有的核苷酸分别约为2 900个，1 540个和120个。20世纪60年代末，Woese开始采用寡核苷酸编目法对生物进行分类，他通过比较各类生物细胞的rRNA特征序列，认为16 s rRNA及其类似的rRNA基因序列作为生物系统发育指标最为合适。由于l6 S rRNA序列的保守性和存在的普遍性，以及核酸序列本身的稳定性，序列分析的重现性极高，基于当今分析技术的改进，应用16 S rRNA作为分子指标，可以实现快速、微量、准确简便的对微生物进行分类鉴定。16 S rRNA基因PCR扩增与计算机分析相结合已被证明是鉴定病原菌快速、有效、准确的方法，再加上生物芯片的不断开发，相信感染性疾病病原菌的检测将迈上更高的台阶。通过透视电镜观察其细胞形态, 并以16S rRNA的保守型序列为引物进行PCR 扩增,扩增产物回收、克隆、测序后,将所得序列与BLAST数据库进行同源性分析,进行解磷菌菌属鉴定。采用分子生物学方法进一步对解磷细菌进行遗传学鉴定,即提取解磷菌的基因组DNA 并对其核糖体的16S rRNA 保守型序列进行PCR 扩增。 PCR 扩增产物切胶回收、克隆、测序并用DNAStar 分析软件将其序列与GenBank 中近缘种序列进行同源性比对^[16]。

（3）研究方法及途径