精氨酸脱亚胺酶的重组表达及催化合成L-瓜氨酸文献综述
2020-05-15 10:05
1 精氨酸脱亚胺酶(ADI)简介
精氨酸脱亚胺酶(Arginine deiminase, EC 3.5.3.6)简称 ADI，广泛存在于细菌、古细菌以及一些真核细胞中。1933年，F. Horn 首次报道在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中发现了 ADI。随后，国内外研究者相继报道了来源于假单胞菌、乳球菌、支原体、乳酸杆菌属、盐杆菌和一些真核细胞等的 ADI；但目前还没有关于在高等真核细胞中发现 ADI 的报道。
在微生物体内的精氨酸代谢途径中，ADI 催化第一个反应，将精氨酸水解生成L-瓜氨酸和氨；L-瓜氨酸在另外两种酶即鸟氨酸氨甲酞基转移酶(OTC, EC 2.1.3.1)和氨基甲酸盐激酶(CK, EC 2.7.2.2)的作用下完成氨代谢。1 mol精氨酸被降解，可产生1 mol ATP，因此该途径是一些微生物的主要能量来源。
目前，国内外研究者对于 ADI 的研究较多，主要将其用于医药领域疾病的治疗和L-瓜氨酸的制备。在医学方面，ADI 可以治疗精氨酸缺陷型肿瘤、白血病以及乳腺癌等；另外可以利用 ADI 的水解功能制备 L-瓜氨酸。
在 ADI 的制备方面，国内外对微生物来源的 ADI 研究较多，其中包括野生菌和基因工程菌发酵制备。2006年，李加友等人利用 Enterococcus faecalis 发酵制备 ADI，ADI 比酶活为2.57 U mL-1。2008年，孟繁君利用 Pseudomonas 发酵制备 ADI，ADI酶活为2.17 U mL-1。2011年，张媛媛等人利用 P. putida UN 0705发酵制备 ADI，ADI酶活为9.32 U mL-1。野生菌发酵制备 ADI 的产量在通常情况下很低，无法满足工业化生产及应用的需求。
由于 DNA 重组技术不断发展，构建基因工程菌从而提高 ADI 表达水平的研究报道逐渐增多，其中以最常用的大肠杆菌为表达宿主开展 ADI 重组表达的研究最为广泛。目前已有多种不同微生物来源的 ADI 基因被克隆，并在大肠杆菌中表达。1989年，Robert A. B 等人将 Streptococcus sanguis NCTC 10904的 ADI 基因在 E. coli 中表达。1994年，Takaku 等人将 M. arginini 的 ADI 基因在 E. coli 克隆表达，ADI 比酶活为33.6 U mg-1。2002年，Yamina O 等人将 P. aeruginosa 的 ADI 基因在 E. coli 中表达。同年，Frederick W 等人将 M. hominis 的 ADI 基因在 E. coli 中克隆表达，ADI 比酶活为19-21 IU mg-1蛋白。2007年，郑迎迎等人将人 I 型精氨酸酶基因中在 E. coli 中克隆表达，酶活为34.6 U g-1湿菌体。同年，Jong-Eun Kim等人将 L. latis ssp. lactis ATCC 7962的 ADI 基因在E. coli BL21中克隆表达，比酶活为2.16 U mg-1。2010年，谭玲玲等人将 M. arginini的 ADI 基因在 E. coli 中表达，ADI 比酶活为38 U mg-1。2011年，刘咏梅等人将 P. plecoglossicida CGMCC 2039的 ADI 基因在 E. coli 中克隆表达，ADI 酶活为2.04 U mL-1发酵液。在上节所述有关 ADI 表达的报道中，发现所有的 ADI 天然均为胞内表达型蛋白，因此当采用 DNA 重组技术进行异源表达时，仍然采用胞内表达的方式，ADI 需要经过细胞破碎释放到培养基中，工艺较为繁琐。
然而，与胞内表达相比，重组蛋白的胞外表达不但有助于蛋白构象的折叠，降低包涵体形成的几率，从而提高蛋白的整体表达水平，而且能够减少宿主细胞内的杂质污染，简化下游提取工艺，因此胞外表达方式在蛋白制品的规模化生产中具有较为显著的优势。2010 年，李娜将 P. plecoglossicida 的 ADI 基因克隆到含有阿拉伯糖启动子的pBAD-glnB 分泌型表达载体中，将重组质粒 pBAD-ADI 转化到 E. coli ToP10F#8217;中，采用L-阿拉伯糖于 25#176;C 诱导，全细胞酶活达到 68 mU mL-1。通过渗透压休克法使 ADI 释放到周质空间，经测定发现周质空间的 ADI 酶活为 53 mU mL-1，细胞内的 ADI 酶活为 34 mU mL-1。 此研究虽然实现了 ADI 在周质空间的表达，但酶活太低，难以满足工业需求。
2 L-瓜氨酸简介
L-瓜氨酸(L-citrulline)是一种非蛋白质氨基酸，参与生物体内的氨代谢。ADI 可以催化 L-精氨酸或者 L-精氨酸盐酸盐水解生成 L-瓜氨酸。国外对于 L-瓜氨酸的研究较多，尤其是日本、美国以及欧洲。近年来，越来越多的研究报道，L-瓜氨酸由于其重要的生理功能，具有广阔的应用前景。
L-瓜氨酸在抗氧化方面的显著效果，使其可应用于医药用品、化妆品、保健食品和食品添加剂等领域。目前，国内外的多家品牌已利用 L-瓜氨酸的功能开发出了医用指示剂、抗艾滋病药物以及保健品等产品。已有研究显示出 L-瓜氨酸广阔的应用前景和巨大的市场需求量，因此开发出低成本、大规模的 L-瓜氨酸生产方法愈发迫切。
