线粒体双光子荧光示踪剂的设计、合成与生物成像开题报告
2020-05-10 02:05
1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）
1 研究背景
当前，细胞器的研究一直是认识细胞结构和功能的重要手段。线粒体是细胞的能量工厂，参与众多的新陈代谢过程。研究发现，线粒体的数量、分布于细胞生命活动的旺盛程度密切相关，在细胞的增殖、分化、细胞间信号传导、细胞内自由基生成等生理活动中起到重要作用；并与癌症、老年痴呆等疾病关系密切。
荧光成像技术为在活细胞/组织等复杂生物环境中对生物目标物的活性进行原位实时监测提供了可能。观测细胞内分子荧光成像的仪器有激光扫描工共聚显微镜和双光子荧光显微镜，其中双光子荧光显微镜在成像活细胞方面的优势更为明显。
因此，对能在活细胞内使用并具有高线粒体定位能力和良好双光子性能的荧光探针的研究迫在眉睫。
2 课题思路
2.1线粒体荧光示踪剂的优势及选择
线粒体是真核细胞重要的细胞器，它不仅是机体的能量代谢中心，而且还参与多种重要的细胞病理过程。县里提出了合成ATP、调节氧化还原电势、调控细胞凋亡和基因表达外，还在生物生长、发育、衰老、疾病、死亡以及生物进化等方面具有重要意义。线粒体不仅为人体生命活动提供能量， 还积极参与多种生理过程，它的异常与癌症、糖尿病、阿尔茨海默病等疾病相关，同时线粒体对各种外界损伤又极为敏感，通常其数量、大小和结构随损伤均有改变。细胞受到损伤时，线粒体可由线状变大或者变圆，损伤严重时可变成小空心泡状结构。
目前已报道的定位于线粒体的荧光探针主要分为 3 大类：一类是基于线粒体带有-180 mV 的膜电位，进而利用本身带有正电荷的荧光团或者在荧光团中引入三苯基膦等正电荷基团来实现其对线粒体的染色；另一类是将探针与能够标记线粒体的蛋白质或者短肽链连接（一般由 20～40 个氨基酸序列组成），进而达到线粒体特异性染色的目的。这类探针具有较好的生物相容性，但水溶性差、细胞通透性不好等限制其应用发展；第 3类是利用胶束或者囊泡将药物等不能够渗透线粒体膜的物质包裹，进而选择性堆积在线粒体。一般选用带有正电荷的脂质体等作为囊泡的外表面，通过内吞作用，磷脂层与线粒体膜相融合后释放内含物。该类探针能够将带负电的药物或者大分子协同带入线粒体内部， 但是内含物的释放率是值得关注的方面。
现在大多数线粒体定位类荧光探针是基于线粒体负膜电位特性，利用本身带有正
电荷的荧光团或者在荧光团中引入带有正电荷基团，实现对线粒体的染色，其中最为常用的是三苯基膦正电荷基团。
2.2双光子荧光示踪剂的优势
近年来，荧光示踪剂越来越受到人们的关注；目前，市面上可采购的探针都是单光子荧光示踪剂。荧光成像技术为在活细胞/组织等复杂生物环境中对生物目标物的活性进行原位实时监测提供了可能。基于体内荧光标记技术（Fluorescence labelling technique）的双光子诱导荧光显微镜（Two-photon excited fluorescence microscopy, TPFM）的诞生为组织和活体样本成像掀开了新的篇章。双光子荧光显微与成像技术与传统的单光子激发荧光显微技术相比具有许多突出的优点：(1)双光子荧光显微与成像技术一般采用在生物组织中穿透力较强的红外激光（~800 nm）作为激发光源，从而有效避免生物组织中深层物质的层析成像和生物细胞的光致毒问题; (2)由于双光子荧光波长远离激发光波长，因此双光子荧光显微与成像技术可以增加信噪比，实现暗场成像；(3)光漂白区域小；(4)双光子跃迁具有很强的选择激发性，有利于对生物组织中一些特殊物质进行成像研究；(5)双光子荧光显微与成像技术具有更高的横/纵向分辨率。另外，由于材料的双光子吸收与激发光强的平方强烈相关，在聚焦的条件下，双光子吸收限域于物镜焦点处空间体积约为激发光波长三次方的小范围内，因此不使用共聚焦小孔，即能得到高清晰度的三维图像，使显微镜的设计大为简化，更加易于操作。同时，由于使用较长波长的光来激发样品可以避免紫外光对样品的伤害和使用复杂的紫外光学元件的许多限制，延长了对活体生物样品的观察时间。虽然TPFM具有上述的诸多优点，但是目前其在生物活体成像研究中应用尚不广泛，主要原因是缺乏双光子吸收截面与荧光量子产率足够高的荧光标记物和在复杂生物体系内高效的荧光标记方法。传统的荧光物质（如荧光素）和荧光蛋白的双光子吸收截面都较小，在实验中必须通过采用高强度激光激发高浓度荧光物来获得足够强的上转换荧光，这样就加大了活体生物样品的观测难度。因此，寻求具有高荧光量子产率和大双光子吸收截面的小分子荧光标记物和标记方法（Small molecule-based protein labelling techniques/probes）就成为这个领域的研究热点。
双光子荧光显微成像由于兼具诸如近红外激发、暗场成像、避免荧光漂白和光致毒、定靶激发、高横向分辨率与纵向分辨率、降低生物组织吸光系数及降低组织自发荧光干扰特点而显著地优于单光子荧光显微成像,为生命科学研究提供了更为锐利的工具。用于研究离子的含量及其对生理的影响、离子参与的生理活动机制、离子与分子的作用、特定分子的分布及其相互作用等方面的光子荧光探针,是实现成像的关键。双光子荧光探针的研究旨在促进双光子荧光显微镜应用的发展,促进命科学、医学科学的快速发展,同时也带动双光子荧光探针所隶属的化学这一学科的发展。因此对双光子荧光探针的研究具有重要的理论和实践意义。
3科学原理
3.1双光子原理
双光子吸收是指在强光激发下,介质分子同时吸收两个光子,从基态跃迁到两倍光子能量的激发态的过程。早在1931年,Gouml;ppert-Mayer就在理论上预言了双光子吸收的存在。但是,直到上世纪60年代初激光器出现后,才由Kaiser等首先从实验上证实了双光子吸收过程。然而,由于一般材料的双光子吸收截面很小,双光子吸收的实际应用受到限制,使双光子吸收研究一直停留在基础研究水平。1990年,美国康奈尔大学Denk等提出将双光子激发现象应用到共焦激光扫描显微镜中,开辟了双光子荧光显微和成像这个崭新的领域。近年来,有机双光子吸收材料在诸多领域,尤其是双光子荧光显微和成像中的应用得到了广泛的关注。设计和合成双光子吸收截面大和上转换荧光强的有机分子能大大促进双光子荧光显微成像在生物系统中的应用,包括单分子检测、免疫测定、DNA片断测定、化学和生物传感器、生物微芯片、毛细管分离检测等。在大量的实验和理论研究基础上,人们总结出有机双光子吸收材料的一些结构-性能关系,提出了许多行之有效的设计及合成策略,大大推动了双光子吸收应用的发展。
3.2双光子荧光探针发生作用的机理
双光子荧光探针与单光子荧光探针的设计原理基本是一致的,作为一个探针分子,它由两部分组成:一是荧光团(fluorophore);二是离子团(ionophore)或称作受体(receptor),不一定局限于离子,从广义上讲,发生作用的对象除了离子外还有分子甚至大分子,因此最好称作受体。从作用机制来讲有如下几种:一是分子内电荷迁移机理(intramolecular chargetransfer, ICT),受体与客体作用后削弱了受体的供电能力,导致荧光团上的电子云密度降低。如果受体结合客体前对荧光团表现为供电基,则体系的荧光减弱;反之,则荧光增强。在ICT过程中常伴有吸收波长与发射波长的红移或蓝移(图1)。
二是光诱导电子迁移过程(photoinduced electron transfer, PET), 探针在未结合客体不发荧光或荧光很弱,这是由于受体的HOMO轨道(最高占据分子轨道)能量高于荧光团的HOMO轨道能量,受体上的电子通过光诱导跃迁到荧光团的HOMO上,致使荧光团的荧光猝灭。而当受体接合客体后,体的HOMO轨道能量显著降低(低于荧光团的HOMO轨道能量),这样受体上的电子不能通过光诱导跃迁到荧光团的HOMO上,此时荧光团自身的LUMO(最低空分子轨道)接受一个光子再通过能级跃迁将接受的光子释放出来,回到HOMO能级,从而发出荧光(图2)。
三是共振能量迁移(resonance energy transfer, RET)过程,探针一般是两个荧光团(可相同也可不同)通过一个柔性受体连接起来,未接合客体前两个荧光团紧密相靠,产生共振能量迁移而自猝灭,分子不发荧光或荧光很弱;一旦受体接合客体后,两个紧密相靠的荧光团就因客体的被包裹而被彼此远远推开,共振能量迁移被阻断,荧光团就发出荧光(图3)。
4 性能测试及生物成像
如图4由于三苯基膦基团的引入，使得可以定位于活细胞中的线粒体，并且对线粒体中次氯酸的含量可通过共聚焦成像。
图5，2014年，新加坡国立大学的刘斌教授，通过三苯基膦基团的线粒体定位功能，很巧妙的利用癌细胞的线粒体膜电位比正常细胞更负，设计合成一例聚集态发光的探针AIE-mito-TPP，该探针可以选择性堆积在癌细胞中的线粒体上，并且通过探针的聚集达到荧光从无到有的过程。另外探针进一步对即可以诱导线粒体产生更多的活性氧，达到杀死癌细胞的目的。
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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案
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1. 路线设计 见附件 2拟采用的研究手段
合成以三苯基膦基团为靶向基团的线粒体双光子荧光示踪剂，采用凝胶成像，荧光仪，酶标仪等对不同条件下合成产物靶向线粒体的性能进行测试。 1.测试产物光学性质（分别进行单光子和双光子荧光成像，比较谱图） 2.生物成像（检测目标产物的靶向性能）
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