泛解酸内酯的外消旋混合物的一步微生物转化为光学活性D-(-)-泛解酸内酯

SAKAYU SHIMIZU，* SHIZUO HATTORI，HIROYUKI HATA， HIDEAKI YAMADA

日本京都大学京都大学农业化学系

摘要：在泛解酸内酯的外消旋混合物中，发现红球菌的洗净细胞IFO12540仅能将泛解酸内酯的L-( )-同分异构体转化为D-(-)异构体。在合适的反应条件下，D-(-)-泛解酸内酯的用量为18.2mg/ml（94.4%对映体过量；摩尔收率90.5%）。这一转换建议通过以下的后续反应进行：第一，L-( )-泛解酸内酯酶氧化成酮基泛解酸内酯；第二，酮基泛解酸内酯的快速和自发地水解成酮基泛解酸；然后，酮基泛解酸酶解成D-(-)-泛酸。在反应后 D-(-)-泛解酸可以通过酸处理来进行乳化。在转化过程中，最初存在于反应混合物中的 D-(-)-异构体没有进行任何修饰。

D-(-)-泛解酸内酯，相应的y-内酯是D-( )-泛酸的化学合成的重要中间体。D-(-)-泛解酸内酯的常规合成过程涉及从异丁醛、甲醛、氰化物和外消旋泛解酸内酯对D-(-)-泛解酸内酯的光学分辨率。这个过程的缺点是，外消旋的泛解酸内酯的麻烦问题的解决，接着是剩余的同分异构体的重新定位。

省略解决方案重新化的步骤的一些方法已经被报道了。Lanzilotta等人.报道说，当纯黄丝衣霉细胞被用作催化剂时，泛解酸内酯被不对称地还原为D-(-)-泛解酸内酯。白色念珠菌、红酵母和一些真菌菌种也被证明对这种酶的减少有用(5,5a, 8)。Achiwa等人和Ojima等人的结果表明，同样的还原作用也发生在铑络合物催化下。

另一方面，还没有报道使用外消旋的泛解酸内酯来制备D-(-)-泛解酸内酯，而不是涉及再化步骤的案例。因为外消旋的泛解酸内酯比酮基泛解酸内酯更容易获得，所以我们尝试用它来进行这样的微生物过程，这样就不会再重新进行了。为此，我们筛选了能够催化这种转化的微生物。我们发现，经过清洗的红球菌的细胞，在没有对共存的D-(-)同分异构体进行任何修饰的情况下，将消旋的泛解酸内酯混合物中的L-( )-同分异构体转化为D-(-)-异构体。在此基础上，我们报道了一种新型高效的单步转换方法，该方法是用泛解酸内酯的外消旋混合物制备D-(-)-泛解酸内酯。这一转化过程所涉及的反应也被阐明了。由于该方法简单，不需要再化步骤，这对于常规的化学分辨率是非常必要的，对D-(-)-泛解酸内酯的实际制备具有很大的优势。

材料和方法

化学药品。D-(-)-， L-( )-，和DL-泛解酸内酯的分析样品从东京透 (东京，日本)购买。酮基泛解酸是在日本大阪的Seitetsu Kagaku公司获得的。根据气液色谱分析，样品纯度超过99%（5）。采用碱性水解法制备酮戊二醇酯酸（2）。所有其他的化学物质都曾被描述过（5）。

微生物和培养。本研究中使用的所有菌株都是在实验室中保存的类型培养物（AKU[农业学院，京都大学]类型文化收藏）。每一种生物都生长在含有1.2% 1,2-丙二醇，1% 蛋白胨(醍醐营养，大阪，日本)，1.5%大豆水解物(味之素，日本东京)，0.15%酵母提取物(东方酵母，东京，日本)，0.4% K₂HPO₄ (pH 7.5) 的培养基中。通常,在试管中进行培养（16到165毫米）包含5毫升的媒介在28°C 下3天的摇晃(每分钟240轻移)。在大规模栽培中，使用了含有500毫升培养基的2升摇瓶。这些细胞由离心收集，然后用于反应，如下所述。

筛选能够将L-( )-泛解酸内酯转换为D-(-)-泛解酸内酯的微生物。来自5毫升培养液中的细胞悬浮在3毫升的200毫米磷酸钾(pH值7.0)中，其中包含90毫克(0.69mmol)的L -( )-泛解酸内酯和45毫克的碳酸钙，然后混合在试管中摇晃了（16到165毫米），保持2天28°C和每分钟240轻移。用离心分离细胞后，对上清液进行了泛解酸内酯和酮基泛解酸内酯的分析，并确定了D-(-)-和L-( )-泛解酸内酯的比值，如下所述。

红平红球菌的洗涤细胞反应。通过上面提到的筛选过程，被选为最有希望的转化催化剂的红平红球菌IFO 12540，如上文所述，生长了3天。这些细胞通过离心分离，用去离子水清洗，然后用于下面描述的反应。

（i）与L-( )-泛解酸内酯反应。洗涤细胞（35mg[干重]；通常从5毫升的培养液中提取。）

表1 通过被选放线菌从L-( )-泛解酸内酯形成D-(-)-泛解酸内酯

在含碳酸钙 50 mg和L-( )-泛解酸内酯30 mg(0.23 mmol)的200 mM磷酸钾(pH 7.0)3ml中摇动10h，正如以上描述的。在研究酮基泛解酸内酯或酮泛解酸转化为D-(-)-泛解酸内酯时，用各自的酮丙基化合物等摩尔量取代了L-( )-泛解酸内酯。

（ii）与DL-泛解酸内酯反应。洗涤后的细胞(35~70 mg)，加入含50 mg碳酸钙和60 mg(0.46 mmol)DL-泛解酸内酯的磷酸钾(ph 7.0)3ml，摇匀2d，第3天加入150 mg葡萄糖和0.1 mgCoCl₂，再摇匀2天。

（iii）D-(-)-泛烷基内酯的制备、缩合反应及分离。用含2.0 g DL-泛解酸内酯、1.5 g碳酸钙、20 mmol磷酸钾(pH 7.0)和150 mg细胞的隔板瓶，在旋转摇床上28°C和260 rpm摇动2d。第3天，加入5 g葡萄糖和33 mg CoCl ₂，再摇匀4天，再将混合物离心，上清液调至pH 1.0，加入6 N H₂SO₄，在80℃下加热15 min。加入Na₂SO₄(35g)后，用100 ml甲基异丁基酮提取上清液中的内酯类化合物。有机层在减压下蒸发。残渣中的泛解酸内酯由甲苯中结晶(产率，1.41 g)。分析数据如下：气相色谱(5)测定泛解酸内酯纯度，96.0%(基于体重)；光学纯度，100%对映体过量[e.e.；100 x(D-(-)-泛解酸内酯-L-( )-泛解酸内酯)/(D-(-)-泛解酸内酯 L-( )-泛解酸内酯)]；熔点，91°C；¹H NMR（二甲基亚砜-d6），delta; 1.00 (s， 6H)，3.82(s，2H)，3.96 (d， J = 6 Hz，1H)，5.78 (d， J = 6 Hz，1H) ppm；质谱，m/z，71, 57, 55, 53, 45, 43, 41, 39, 31, 29, 27。

分析。上清液(1.0 ml)的所有黄原酸盐，加入1.0 ml 6 N HCl，在80℃下加热15 min，转化为相应的内酯形式。在乳化液中加入1.0 ml乙酸乙酯，然后将混合物大力摇匀1 min。用气相色谱(GC-7AF；Shimadzu)和火焰离子化检测器对泛解酸内酯和酮基泛解酸内酯的有机层进行了分析。测量的细节已经描述过(5)。除非另有说明，我们分别对泛解酸内酯和泛酸的混合物和酮烷内酯和酮戊酸的混合物使用了泛解酸内酯和酮基泛解酸内酯的术语。为了测量内酯形式的实际数量，上清液分析了无内酯化的泛解酸内酯和酮基泛解酸内酯。通过将内酯化前的泛酸值与内酯化后的值相减，计算出泛酸的实际用量。同样地，酮泛解酸的实际用量被确定为酮基泛解酸内酯值与不内酯化时的差值。采用L-氯甲酸薄荷酯(6)非对映体转化法测定了D-(-)-和l-(-)-泛解酸内酯的比值，如上文所述(5)。

其他方法。细胞干重从610 nm的培养液光密度与细胞干重的校准曲线中读取，在110°C烘箱中隔夜烘干，测定细胞干重。用日立M-80和Nicolet NT-360仪器分别测量了质量和¹H核磁共振谱。

结果与讨论

从L-( )-泛解酸内酯中生成D-(-)-泛解酸内酯。利用不同的细菌菌株，初步测定了L-( )-泛解酸内酯转化为D-(-)-泛解酸内酯的活性，正如上面描述的。这种活性广泛存在于红球菌属、诺卡氏菌属、马杜拉放线菌属、球孢子菌属、罗思氏菌属、假单胞菌属(表1)。在所有情况下，酮基泛解酸内酯也被检测为另一反应产物。相反，没有检测到D-异构体转化成L-异构体，以酮基泛解酸内酯，或两者（数据未显示）。正如红平红球菌 IFO 12540显示的最有力的活动，我们在下面的实验中使用它。

L-( )-泛解酸内酯转化为D-(-)-泛解酸内酯的反应。由于上述结果表明，该转化是以酮基泛解酸内酯为中间体，通过立体定向氧化还原反应进行的，我们对其转化机理进行了较为详细的研究。令人惊讶的是，在整个反应过程中，以L-( )-泛解酸内酯为底物的反应混合物中既未检出酮基泛解酸内酯，也未检出D-(-)-泛解酸内酯。结果表明：L-( )-泛解酸内酯的浓度随反应时间的增加而降低。酮基泛解酸内酯和D-(-)-泛解酸内酯只有在内酯化后才被检测到，它们在反应混合物中的含量之和与消耗的L-( )-泛解酸内酯(图.1a)相当。

同样，用酮基泛解酸内酯代替L-( )-泛解酸内酯时，也没有检测到酮基泛解酸内酯或D-(-)-泛解酸内酯。同样，最初加入到反应混合物中的酮基泛解酸内酯在内酯化反应后才被完全恢复为酮基泛解酸内酯和D-(-)-泛解酸内酯的混合物（图1b）。这些结果表明，酮丙基和d-(-)-泛基化合物都以相应的酸形式存在，即，酮泛解酸和D-(-)-泛酸；以及除酮泛解酸和D-(-)-泛酸外，没有其他副作用。众所周知，酮基泛解酸内酯在温和的中性和碱性条件下能自发地水解成酮泛解酸，类似于图1(2)中所示的实验所使用的条件。另一方面，泛解酸内酯几乎不能水解成泛酸(2)。因此，酮泛解酸的形成是由L-(-)-泛解酸内酯水解的结果。事实上，在没有细胞作为催化剂的情况下，酮基泛解酸内酯可以被水解。此外，水解速率与细胞的水解速率基本相同(在相同条件下，在图1b所示的实验条件下，每分钟超过1毫克/毫升)，表明水解的主要部分是非酶的。其他支持酮泛解酸形成的证据是，在没有碳酸钙的情况下，反应混合物迅速酸化(数据未显示)。这些结果表明，酮泛解酸是由L-( )-泛解酸内酯酶氧化生成酮基泛解酸内酯，再由其自发水解而成。

当用酮泛酸代替酮基泛解酸内酯时，还原速率与图1b所示的实验基本相同，表明还原为泛酸的底物是酮泛解酸而不是酮基泛解酸内酯。还原反应还进行了立体定向反应，得到了D-(-)-异构体。因此，这一还原反应与酮基泛解酸内酯的还原反应有很大的区别，而D-(-)-泛解酸内酯的还原反应是以前报道过的(2，7)。D-(-)-泛酸可能是由某些羰基还原酶如酮泛解酸还原酶(EC 1.1.1.169)作用而形成的。经酸处理可使D-(-)-泛酸容易发生乳状化。

对反应混合物的pH值接近中性的维护似乎对L-

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