一种环境抗生素的分析检测方法的建立毕业论文
2020-02-19 03:02
摘 要
抗生素的大量生产及滥用所造成的环境污染引起国内外极大关注，其中环境样品中痕量抗生素的检测一直是环境分析工作者致力解决的问题。本文在了解了抗生素的来源、影响和去除情况基础之上，选取了喹诺酮类抗生素中的环丙沙星作为研究对象，建立了一种固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定环丙沙星的方法。采用Oasis HLB固相萃取柱净化和富集合成废水中的抗生素，选用甲醇、丙酮和正己烷的混合溶液(v:v,1:1)作为洗脱剂，洗脱体积为6 mL。仪器检测条件为：采用Waters TQ超高效液相色谱-串联质谱，以0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液作为流动相，进行洗脱分离，在多反应检测模式(MRM)下进行监测。实验结果：环丙沙星的回收率为89.47 %～127.47 %，检测限为0.477μg L-1,定量限为1.59 μg L-1。并用该方法对合成废水样品进行检测，证明该方法可满足实际检测要求。
关键词：抗生素；环丙沙星；固相萃取；超高效液相色谱；质谱
Abstract
The environmental pollution caused by the mass production and abuse of antibiotics has attracted great attention at home and abroad. The detection of trace antibiotics in environmental samples has become a problem that environmental analysts are trying to solve. Based on the understanding of the source, influence and removal of antibiotics, ciprofloxacin was selected as the model quinolone antibiotics in this work to develop a sensitive analysis method using solid phase extraction combined with ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The Oasis HLB solid phase extraction column was applied as sample pretreatment for the aim of concentration and purification. Methanol and a mixture of acetone and hexane (v:v, 1:1) were used as the eluent with each volume of 6 mL. Waters TQ ultra performance liquid chromatography was set with 0.1% formic acid aqueous solution and 0.1% formic acid acetonitrile solution as mobile phase. Mass spectrometry was running at multiple reaction monitoring mode (MRM). Experimental results showed that the recovery rate of ciprofloxacin was 89.47-127.47%, the limit of detection was 0.477 μg L-1, and the limit of quantification was 1.59 μg L-1. The method was applied to the detection of synthetic wastewater samples, which proved that the method can meet the actual requirements.
Keywords：antibiotic；ciprofloxacin；Solid Phase Extraction；Ultra performance liquid chromatography; Mass spectrometry
目 录
第1章 绪论 1
1.1 抗生素的概念及分类 1
1.2 抗生素的影响 1
1.2.1 影响微生物 1
1.2.2 影响植物 2
1.2.3 影响人类健康 2
1.2.4 影响农业 2
1.3环境中抗生素的去除 3
1.4 抗生素的萃取方法 3
1.4.1 膜萃取 3
1.4.2 固相萃取（SPE） 3
1.4.3 固相微萃取（SPME） 4
1.5 喹诺酮类抗生素的常用检测方法 4
1.5.1 高效液相色谱法 4
1.5.2 高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS/MS） 4
1.5.3 超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS/MS） 5
1.6 研究目标和内容 5
第2章 实验方法 7
2.1 实验仪器与试剂 7
2.1.1 实验仪器 7
2.1.2 实验试剂 8
2.1.3标准品 8
2.2实验过程 9
2.2.1水样的配制 9
2.2.2 水样的过滤、萃取及浓缩 10
2.2.4 内标物的选择 11
2.2.5 色谱、质谱条件 11
2.2.6 加标回收率实验 12
第3章 结果与讨论 13
3.1 实验结果 13
3.1.1 环丙沙星（CIP）标准曲线的绘制 13
3.1.2 色谱分析 13
3.1.3 质谱分析 14
3.1.4 回收率 15
3.1.5 相对标准偏差 16
3.1.6 LOD和LOQ 17
3.2 讨论 17
3.2.1 定量分析方法讨论 18
3.2.2 UPLC-MS实验方法对比 18
结论 21
参考文献 22
致谢 24
第1章 绪论
1.1 抗生素的概念及分类
抗生素是由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)所产生的具有抑制其他类微生物生长、生存的一类次级代谢产物，以及用化学方法合成或者半合成的类似化合物。它的定义比较广，包括抗细菌抗生素、抗真菌抗生素以及对付其他很小的病原体的抗生素。抗生素能够让肠道的菌群落失调[1]。抗生素主要分为以下几类：
β-内酞胺类:这类抗生素包括两个重要组成部分，分别是青霉素类和头抱菌素类，他们共同的特点是具有卜内酞胺环特殊结构，其作用机理是产生抑制细胞壁粘肤合成酶，阻止细胞壁粘肤合成，最终破坏细菌胞壁，杀死细菌。
磺胺类药物：是历史上第一种人工合成的抗菌药物，1932年，德国病理学家格哈德·多马克发现第一种磺胺类药物百浪多息。他用实验说明了百浪多息可以使鼠、兔不被链球菌、葡萄球菌感染[2]。目前，磺胺类抗生素已经发展壮大，主要有磺胺嘧啶（Sulfadiaaine)、磺胺甲嘧啶(Sulfamerazine)、磺胺甲恶唑(Sulfamethoxazole) 、磺胺二甲嘧啶(SulfamethazineBase)。
氟喹诺酮类: 氟喹诺酮类抗菌剂含有4-喹诺酮的基本结构，抑制细菌DNA的选择性溶解。在1962年的临床实践中，第一次使用喹诺酮和萘啶酸。当前应用的喹诺酮大多为含有氟原子的氟喹诺酮类[3]。常用的喹诺酮类抗生素有诺氟沙星、环丙沙星等。
四环素类:指一类具有四苯基本骨架的广谱抗生素药物，此类药物作用机制是通过抑制基因转译而达到抑制细胞生长的目标。四环素类代表性的药物有金霉素、土霉素等。在治疗疾病的同时，四环素也有一些不良影响包括:肝、肾的损伤;影响牙齿及骨骼等。
1.2 抗生素的影响
1.2.1 影响微生物
一种抗生素只对部分微生物有抑制作用，而对其他微生物无效，这是因为不同的抗生素对于微生物的作用部位不同。氯霉素、四环素、土霉素、链霉素导尿管能与核糖蛋白结合，导致微生物难以合成蛋白质。青霉素抑制革兰氏阳性菌肽聚糖的合成，促使细菌无法合成细胞壁，菌体丧失了细胞壁的保护，又因细胞内渗透压高于环境，细菌细胞发生渗透性吸水，细菌就会膨胀或者裂解死亡。博来霉素与DNA结合，会阻碍DNA的复制。因此，抗生素的种类不同，对微生物的影响就大不相同[4]。
1.2.2 影响植物
抗生素对植物的影响跟抗生素种类、植物、土壤类型不同，有很大的区别。大多数情况下，低浓度抗生素可促进植物生长，高浓度抗生素对植物有抑制作用。张晓晗等采用单因素的方法，分析绿藻对不同浓度抗生素的敏感性，同时定量分析3种抗生素在单一及联合作用下对绿藻生长的半抑制浓度。结果表明:单一及联合抗生素对淡水绿藻均表现为“低促高抑”[5]。Boxall等发现，土壤条件下，一定浓度的土霉素、恩诺沙星显著抑制胡萝卜的生长，而相同浓度的阿莫西林、甲氧苄啶对这两种蔬菜没丝毫影响[6]。
1.2.3 影响人类健康
环境中抗生素的残留对于人类健康存在隐患，滥用抗生素导致了高耐药性的细菌的出现。大多数抗生素进入自然环境后，最终将进入水环境，绝大多数将进入河流和湖泊。目前，大部分的饮用水和日用水来自河流和湖泊，而且大多数污水处理厂抗生素的去除率低。因此，河流和湖泊中的大多数抗生素将留在饮用水中。在喝水过程中，人们服用了抗生素。除了饮用水之外，因为抗生素可以通过生物链传播，当人们吃含有抗生素的动物或植物时，他们自然会把抗生素带到人体。随着时间的推移，人体中的抗生素数量将会增加和更高，从而导致免疫功能下降，导致身体造成有毒损害，导致癌症、身体畸形等。各种食品的污染，特别是含有抗生素的肉类和奶制品的污染，是人类健康的一个重要问题。应该注意的是，食品中的抗生素可能具有固有毒性并且可能具有累积效应。应在使用前评估在生物体内使用该药物的风险-效益比[7]。抗生素在医学上的使用，让我们不在恐惧传染病，有效治愈了很多疾病。但是人类不合理使用抗生素促使“超级细菌”的滋生。细菌耐药性的速度超过了抗生素的研制速度，面对“超级细菌”供我们选择的有效果的抗生素越来来越少，抗生素抵御疾病的能力也逐渐下降[8]。
1.2.4 影响农业
抗生素提高饲料的效率，从而可以用较少数量的动物生产相同数量的肉。提高效率可以减少种植动物饲料所需的耕地面积，减少粪便产量，对农业有积极作用，同时为消费者和生产者带来经济效益。但是中国农业土壤普遍检出四环素类抗生素，部分土壤采样点的四环素类抗生素的含量远大于兽药国际协调委员会(Veterinary International Co-operation on Harmonization，VICH)筹划指导委员会提出的土壤中抗生素生态毒害效应的触发值(100 μg kg-1)，具有一定的生态风险，其中土霉素和金霉素的生态风险相对较高[9]。
1.3环境中抗生素的去除
由于抗生素残留的存在，抗生素抗性细菌(Antibiotic Resistant Bacteria ,ARB)和抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes,ARG)的潜在威胁可能会增加。现阶段大部分污水处理厂的处理能力无法有效去除抗生素，导致很多抗生素进入环境介质。因此，有必要探索各种废水处理技术，消除废水中的抗生素和抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes,ARG)。chenjun等[2]调查了人工曝气和混合设计的各种中型模人工湿地，设立了不同的人工曝气设计。总抗生素的水性去除效率范围为87.4%～95.3%，而总抗生素抗性基因的去除效率为87.8%～99.1%。该研究表明人工曝气的混合人工湿地可以提高抗生素和抗生素抗性基因以及常规污染物的处理效率。N.Dorival-García等[10]使用来自膜生物反应器(Membrane Bio-Reactor,MBR)实验工厂的混合液，在实验室规模的反应器中研究废水中最常见的喹诺酮类抗生素的去除。研究表明初始化学需氧量浓度的降低、活性污泥浓度和温度的升高，喹酮类抗生素的的降解速率增加。该研究通过生物降解、选择条件和控制变量为有效去除水中喹诺酮衍生物奠定了基础。
1.4 抗生素的萃取方法
1.4.1 膜萃取
膜萃取又称固定膜界面萃取，是膜技术与萃取过程相统一的新型膜分离技术。膜萃取过程中萃取相和料液相分别在膜两侧流动，其传质过程是在分隔料液相和萃取相微孔膜表面进行的。Hylton等[11]提出了一种方法：采用微尺度支持液膜萃取和用于酸性和碱性化合物的微尺度液液膜萃取，提取和浓缩水中各种抗生素，富集因子很高，相对标准偏差范围为1.5%～2.0%，检出限低至 92 ng L-1左右。
1.4.2 固相萃取（SPE）
固相萃取(Solid Phase Extraction,简称SPE)是一种自1980年代中期以来开发的取样技术。SPE是主要利用选择性吸附与选择性洗脱的液相色谱法。主要用于样品的分离，净化和富集。主要目的在于降低样品基质干扰，提高检测灵敏度。Rossmann等[12]分析城市水样中的多类抗生素(包括环丙沙星)，选择聚合反相吸附剂和OasisHLB作为吸附剂，采用SPE具有迅速、灵敏、无污染等特点，实现了待测物的收集。Tlili等[13]通过离线和在线SPE-LC-MS/MS同时分析26种药物残留，得到了较好的的回收率。
1.4.3 固相微萃取（SPME）
固相微萃取(solid-phasemicroextraction,SPME)是在固相萃取基础上发展起来的。自1994年出现以来，技术迅速发展，主要用于食品分析、药物分析和环境分析。固相微萃取解决了传统样品前处理技术的缺陷，集采样、萃取、浓缩、进样于一体，大大加快了分析检测的速度[14]。张博华[15]建立了固相微萃取装置，优化了高效液相色谱条件，建立了SPME-HPLC快速富集、分析水中痕量抗生素的方法。再现性好，精度高，相对标准误差小，适用于检测标准样品。
1.5 喹诺酮类抗生素的常用检测方法
1.5.1 高效液相色谱法
高效液相色谱仪(HPLC)，开启了高效色相色谱的时代。高效液相色谱法使用高压泵、高效液相柱和高灵敏度的检测器，分析速度快、分离效果强，操作自动化。高效液相色谱只要求试样能够制备成溶液，而气相色谱对分析沸点过高或者热稳定性差的物质存在较多误差。杨勇[16]等建立了测定牛奶中6种喹诺酮药物残留的高效液相色谱(HPLC)，使用荧光检测器(FLD)的检测方法，在此方法中6种氟喹诺酮分离度较高，重复性、精密度、稳定性试验结果良好，变异系数都在5%之下。王桥军等[12]建立固相萃取-高效液相色谱-荧光检测法测定水中喹诺酮类抗生素含量，4种奎诺酮类抗生素在水中的检出限为0.083～0.248 μg L-1;回收率为63.7%～134.1%，各种水样均不同程度检出这4种奎诺酮类抗生素。可见，这种方法有效可行的，并且价格低廉，能够满足日常分析要求。Yiruhan等[17]采用高效液相色谱荧光检测法分析了广州、澳门自来水中的氟喹诺酮类抗生素，这种方法成功应用于自来水样的分析。结果表明广州和澳门的所有目标抗生素检出率均很高，广州为1.0～679 ng L-1(SD≤37.6)，澳门为2.0～37.0 ng L-1(SD≤2.5)。
1.5.2 高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS/MS）
液相色谱-质谱联用技术起始于1970年，它集液相色谱对复杂有机物超强的分离能力和质谱对有机物相对分子质量及结构信息等的分析能力于一体，因此广泛应用于医药、环境、生物等领域,HPLC-MS经常被用来定量测定复杂混合物的成分。李经纬等[18]采用HPLC-MS的方法，建立了一种同时测定15种抗生素的分析方法。结果表明，该方法在0.50 ng mL-1～250 ng mL-1区间内，相关系数为 0.999，检测到的最大值为0.01 g L-1～2.50 g L-1之间。张律[19]采用HPLC-MS技术对饮用水中的恩诺沙星、磺胺类抗生素等进行了分析。抗生素平均回收率在47%～109.6 %之间。结果表明，该方法效果不错，能力强，比较精确，很可靠，方便快捷，能够用于水中抗生素残留的定性定量分析。姚倩钰等[20]建立高效液相色谱－串联质谱法测定高浓度有机废水中的五种喹诺酮类抗生素试验结果表明，纯水回收率高于61.40%～91.92% ，废水回收率为54.92%～101.87%，采用建立的方法，对21个农场废水中的64种样品进行了分析，测定了五种喹诺酮类抗生素，检出率为47%～95%。该方法快速、准确，对于高浓度有机废水中喹诺酮类抗生素的测定效果好。
1.5.3 超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS/MS）
超高效液相色谱(Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC)借助于HPLC的理论及原理，加入了小颗粒填料、低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。在相同条件下，UPLC能分离的色谱峰比HPLC多出一倍还多，UPLC的分辨率能够认出更多的色谱峰。王建凤[21]等建立了UPLC-MS测定水体中喹诺酮类抗生素的残留状况。采用两次固相萃取，经过C18柱分离的混合物，二次经过 HLB 柱。用甲酸和甲酸溶液作为流动相，进行洗脱。用质谱仪进行测样时，正离子模式(ESI)和MRM检测模式(MRM)进行检测，所有样品线性关系都很好，线性相关系数均为0.990，方法的检出限为0.2～1.0 g L-1，定量限为0.5～2.0 ng L-1，回收率稳定，变异系数大于16%。李佩佩等[22] 建立了UPLCC-MS法测定水体中喹诺酮类化合物的方法。在用甲酸进行溶解之后，用固相萃取柱（SPE)对样品进行进行富集，并用甲酸水溶液作为流动相，进行梯度洗脱结果显示，14种喹诺酮类药物浓度为0.5～50.0 ug L-1，线性相关系数大于0.995。水样的加标回收率为79.8%～95.4%，相对标准偏差均小于10%。14种喹诺酮类药物的检出限为1.00～1.50 ng L-1,定量限为3.5～5.00 ng L-1，结果表明所建立的方法再现性好，灵敏度、回收率高，检测时间短，适用于养殖水体中喹诺酮类药物残留的检测。Speltini[23]等研究一种测定堆肥中氟喹诺酮类抗生素的方法，在含有镁离子作为络合剂的碱性溶液中进行低压微波辅助萃取(MAE),然后采用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS)。通过单个低压微波辅助萃取从堆肥中同时提取四种广泛使用的诺喹酮类抗生素。分析物在色谱中运行、分离10分钟，在单反应监测(SRM)模式中进行定量。对真实堆肥样品的分析表明，喹诺酮类的残留高达88 ng g-1。该方法更便宜、更快、更环保，同时能够适当的回收。
1.6 研究目标和内容
抗生素在环境中的残留量极低，种类非常多，物理化学性质又相差很大，而真实的环境介质又非常复杂，建立灵敏、准确的分析方法成为抗生素研究领域内一个重要组成部分，是开展其他有关研究工作的分析基础。建立合理、高效的预处理方法和灵敏、准确的分析方法已经显得格外重要。本研究的主要内容是建立一类重要的喹诺酮类抗生素--环丙沙星的分析方法：固相萃取(SPE)作为前处理，结合超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)进行定性定量分析，建立环丙沙星的标准曲线，计算该方法的检测限和定量限，利用质量控制手段分析该方法的样品回收率和标准偏差，并应用此方法来检测合成废水中的环丙沙星含量。
第2章 实验方法
2.1 实验仪器与试剂
2.1.1 实验仪器
表2.1 实验仪器
