英语原文共 9 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

低分子量有机酸对铜的作用在急性暴露系统中对蚯蚓毒性的影响

摘要

在本研究中，在模拟土壤溶液中，低分子量有机酸（OAs）影响铜（Cu）对蚯蚓赤子爱（E. fetida）的毒性。我们把蚯蚓暴露于含有Cu和各种OAs（乙酸，草酸，柠檬酸和EDTA）土壤溶液中。我们发现添加了OAs减少了Cu对蚯蚓的毒性，其中还原性在EDTA中最强，乙酸中最弱。暴露于Cu和降低抗氧化酶水平丙二醛对未暴露的对照水平这些化合物降低了蚯蚓的死亡率。 蚯蚓是用OAs暴露于Cu，有可能是减少Cu² 由Cu形成与OAs的复合物引起的，降低了Cu的可用性。 OAs的存在也减少了Cu诱导对蚯蚓细胞超微结构的损伤，改变了Cu的亚细胞分布。这些结果表明OAs可以降低毒性，以及土壤溶液中重金属的生物利用度而且OAs和重金属往往共存。

关键词

有机酸 蚯蚓 铜 毒性亚细胞分布 超微结构

介绍

Cu是生物体中必需的微量元素，但过量Cu可以在生物体内积累而导致有害的影响。 Cu是不可降解的，使其从土壤中去除变得困难（Evangelou et al。2006，Zhouet al。 2012）。众所周知的螯合剂，如低分子量有机酸，可促使植物吸收铜等重金属而被广泛应用加强这些金属的特性植物修复（Meers et al。2009）。许多研究已经表明，OAs增加了金属摄取和金属对植物的毒性。例如，OAs显著增加烟草吸收Cu，特别是EDTA，这可以刺激金属吸收达高于其他有机酸的200倍（Evangelou et al。2006）。类似地，由于增加Pb吸收并将Pb转移到地上部分，普通变形杆菌暴露于Pb和EDTA复合物显示出根系生物量的降低，茎缩短，新鲜叶重量的减少（Geebelen等人2002）。

然而，关于重金属的毒性和可用性对于OAs的影响存在相互矛盾的结果。 而柠檬酸，

苹果酸和草酸可增加Cu对莴苣芽的毒性和生物利用度，低浓度的EDTA和DTPA可以降低Cu的毒性和生物利用度（Inaba等人，2005）。 此外，由于其对Pb的高结合强度EDTA通过形成稳定的蚕豆幼苗的毒性Pb-EDTA络合物可抑制Pb诱导（Shahid等人，2014）。 有趣的是，由于柠檬酸不容易与Pb形成络合物，所以对蚕豆根系的Pb毒性没有影响。 但是，这些矛盾的发现清楚地表明需要进行更全面的研究来更好地理解OAs的机理影响土壤中的重金属可用性。

蚯蚓可用作生物指标进行评估土壤中重金属等异种生物的含量（Lavelle，1988）。蚯蚓容易从周围的土壤堆积重金属（Allen等人2001）以及蚯蚓和其他土壤动物正受到农业生产的快速发展和化学物质增加的负面影响，这些通常对土壤动物有毒性（Sanchez-Hernandez。2006）。蚯蚓通过表皮吸收重金属以及重金属会影响蚯蚓的细胞和生理功能。因此，高浓度的重金属可以导致蚯蚓种群的繁殖生存率降低甚至灭绝当地蚯蚓种群（Spurgeon et al。2003; Zhouet al。 2013年Zhou等2014）。但是，据我们所知，在高浓度重金属的土壤中，是否OAs伤害蚯蚓以及这些OAs是否会导致就像在植物根部一样，重金属的吸收进入蚯蚓的细胞增加，这些都是不清楚的。除了蚯蚓金属积累不清楚之外，涉及调节生产的生理机制的抗氧化酶和Cu的亚细胞分布也不甚了解。土壤蚯蚓在土壤中吸收重金属主要通过表皮对其周围的被动吸收。 （Capowiezet al。 2010; Li et al。 2008; Zhou等2014）。另外，它

也通过胃肠道积累重金属同时消化土壤有机质（Belfroid et al。，1993）。

在这项研究中，我们用赤子爱蚯蚓居住在农田作为模型，并对其用Cu和低分子量有机酸进行处理例如乙酸（CH₃COOH），草酸（（COOH）2），柠檬酸（CH₂ COOH-C（OH）COOH-CH₂COOH）EDTA（（（HOOCCH₂）₂NCH₂）₂）（分别含有1-4个-COOH，简称OAs）。 我们进行了48小时急性毒性试验并测试（i）Cu对蚯蚓的毒性在OAs的影响下的效率和（ii）吸收以及观察蚯蚓中的Cu的亚细胞分布。 我们的研究结果有助于阐明OAs对土壤溶液中铜的毒性的重要性，可以改善土壤中Cu的风险评估。

材料和方法

实验材料

使用实验级的以下化学物质：Cu（NO₃）₂·3H₂O，Ca（NO ₃）₂，MgSO ₄·2H₂O，NaNO ₃，KNO ₃，乙酸（CH₄COOH），草酸（H₂C₂O₄·4H₂O），柠檬酸酸（C₆H₈O₇）和EDTA（C₁₀ H₁₄ N ₂Na ₂ O₈·2H₂O）。太平2号蚯蚓，E. fetida均购自无锡蚯蚓育种基地，在潮湿和黑暗环境以及清洁牛粪丰富的有机物质中养殖和驯养2周，。 成熟的E. fetida体重约300〜500mg，生长期2-3个月选择出来进行实验。 制备土壤模拟溶液按照Belfroid等人的配方 （1993）。 Ca（NO₃）₂，MgSO₄，NaNO₃，和KNO₃在去离子水中稀释以制备模拟物，其中含有0.1mM Ca² ，0.1mM Mg² ，1.0mM ^Na 和0.1mMK 。 使用1.0 M NaOH将系统pH调节至5.5plusmn;0.1。

蚯蚓暴露实验

测定Cu富集时的蚯蚓死亡率

三种不同浓度的Cu（0.78,1.55和2.33mu;）基于当前的研究进行选择（Zhou等人 2012），并与不同的OA浓度混合，包括草酸，乙酸，柠檬酸和EDTA。OAs和Cu之间的摩尔比为0,1和5。不用额外的化学物质来进行实验的空白处理。 将溶液的pH调节至5.5plusmn;0.2。 用溶液处理蚯蚓48小时，检测死亡蚯蚓的数量和Cu溶液的最终浓度。 Cu浓度使用Visual MINTEQ程序进行评估。

OAs对蚯蚓生理影响和在Cu胁迫下的亚细胞分布

在该试验中，选择0.78mu;M Cu并用不同浓度的草酸，乙酸，柠檬酸和EDTA（OAs / Cu摩尔比为0,1和5）进行混合。蚯蚓首先置于湿滤纸上24小时以清除肠道内容物并减少可能通过标准阅读条件被吸收的重金属。蚯蚓用去离子水洗涤，使用滤纸拍打干燥。一百毫升的实验溶液倒入塑料容器中并盖上孔比蚯蚓小的塑料盖防止他们逃脱。溶液在实验中每24小时更换一次，死蚯蚓也要去除（Li et al。2008）。实验是在20plusmn;2℃的黑暗条件下进行。每组实验都要在48小时内测试10次，共有3次独立实验。蚯蚓的前尾用针刺，那些没有反应的被算作死亡。挑选活的蚯蚓，清洁并保存在-70°C环境中（Li et al。2008）

蚯蚓体内Cu含量的测定

将蚯蚓在70℃下干燥48小时，取出放在干燥机中干燥30分钟。 一到两个蚯蚓干燥组分称量后（精度至0.0001g），放入100毫升锥形瓶中，并与15毫升浓缩硝酸和2ml过氧化氢混合，并用小漏斗过滤一夜。 样品在120℃放置2小时，冷却，并加入2ml过氧化氢三次（Li et al。2008）。 然后，样品在150℃下放置1小时。 稍微冷却后，将样品用5毫升2M盐酸混合，加热至250℃，用去离子水稀释到体积为25毫升的体积烧瓶用于测定。 最后，用Mussel的Cu含量标准物质（GBW08571）（国家质量局）测定（Zhou et al。，2014）。

蚯蚓生化指标的测定

在生化分析之前，将每个样品切成块并与0.86％冰冷的NaCl混合。 混合物均化用高速搅拌机在4℃下将样品离心（10,000times;g，10分钟），上清液用于分析生化指标和蛋白质含量。每次实验重复三次，整体匀浆分离过程在4℃下进行。

使用上述实验的上清液测试超氧化物歧化酶（SOD）活性，过氧化氢酶（CAT）活性，

和丙二醛（MDA）含量。 SOD实验用黄嘌呤氧化酶和硝基蓝四唑测定（NBT）系统（Li et al。2008）。 SOD的一个单位定义为抑制NBT发生率使其减少50％时的蛋白质数量（Zhou et al。2013）。 CAT活性测定离心匀浆后根据Zhou等人的方法测定（2013），1 UCAT活性定义H2O2在25℃120秒消耗活性酶的一半。 酶活性为定义为每毫克蛋白质的酶活性的单位。根据Livingstone等人的方法描述，通过形成硫代巴比妥酸来测定MDA含量酸反应物质（1990）。 使用牛血清白蛋白的Bradford测定法标准（Bradford，1976）测定总蛋白质含量。

蚯蚓体内的亚细胞分布和Cu测定

将实验处理的蚯蚓解冻，称重，并匀化（XHF-D，浙江，中国）5.0 ml冰醋酸0.01M Tris-HCl缓冲液（pH7.5，Fisher Scientific），按照Vijver等人描述的方案分级（2006）。简而言之，蚯蚓中的Cu分成5个亚细胞种类。通过10,000times;g离心10分钟分离颗粒级（D）和细胞膜，分离组织碎片和完整细胞（E）。最初的上清液和细胞质析出，在100,000times;g下离心30分钟微粒体（F）从蛋白质中分离出来。蛋白质组分在80℃下加热10分钟，然后置于冰上1小时。然后将样品以30,000times;g离心30分钟，将变性蛋白（G）从热稳定蛋白（H）中分离出来，（Zhou等，2013）。该差速离心分离蚯蚓含量分为五个组分：细胞器（D），细胞碎片（E），微粒体含量（F），热变性成分（G）和热稳定性成分（H）。每个组分用硝酸和过氧化氢混合，稀释到10ml，用分光光度计原子吸收法测定Cu含量。

电子显微镜观察

用含Cu和草酸，乙酸，柠檬酸或EDTA（OAs / Cu摩尔比分别为0或5）的土壤溶液处理蚯蚓。 处理后，蚯蚓被清除肠内容物12小时; 将蚯蚓放在冷湿滤纸上，麻醉10分钟后解剖 取下蚯蚓表皮的1厘米段并修剪成1mm³的大小。样品在4℃下在2.5％戊二醛溶液中固定，用0.1M磷酸盐缓冲液pH7.0洗涤，固定在1％锇酸溶液，脱水并嵌入环氧树脂树脂（Wu et al。2012）。 样品用aReichert超薄切片机挑选，用柠檬酸铅 - 铀乙酸酯酰双色染色，并使用JEM-2100型透射电子成像显微镜（TEM）观察。

统计分析

所有统计学分析均在Windows SPSS 19.0中进行（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）。 结果报告复制三次，TEM数据除外。在进行统计分析之前，检查数据的偏离正态性和均匀性差异。 每个组分的单程方差分析用于评估显著差异（P lt;0.05），差异有统计学意义（P lt;0.05）通过SNK多范围测定（水平alpha;= 0.05）测试和统计学意义进行了评估。

结果

OA实验下Cu² 含量和蚯蚓死亡率的变化

我们用不同浓度Cu和OAs的土壤溶液处理蚯蚓，在不同的处理条件下的死亡率总结在表1中。没有OAs，蚯蚓的死亡率=分别暴露至0.78,1.55和2.33mu;M的Cu为20,43.3和80％。 蚯蚓也用Cu和四种不同种类的OAs在不同情况下，这些导致不同程度上死亡率下降，甚至降至0％。效果最到最弱依次为EDTA，柠檬酸，草酸和乙酸。Cu² 处理后土壤溶液含量显示醋酸酸对其没有显著影响，而草酸，柠檬酸和EDTA降低了Cu² 含量。尤其是，EDTA与Cu相比，Cu² 含量降低了3-7倍。 Pearson相关分析显示蚯蚓死亡率与Cu² 含量具有显著的正相关关系（P lt;0.01，r² = 0.889），在OA处理的样品中蚯蚓死亡率降低是由于Cu² 含量的降低。

在OA处理下，蚯蚓中Cu含量的变化

没有添加OAs，我们观察到在蚯蚓中的Cu水平随着增加土壤中Cu浓度而显著增加（图1）。 用Cu和OAs特定的组合处理蚯蚓导致Cu水平的显着降低。 总体而言，蚯蚓中Cu的减少作用从强到弱依次是EDTA。柠檬酸，草酸和乙酸。 例如，蚯蚓中铜为1.21mu;molg -1用0.78mu;M Cu处理时，比空白对照高49.4％。 当Cu和乙酸/草酸/柠檬酸之间的摩尔比为酸/ EDTA为1，蚯蚓体内的Cu浓度分别为1.18,1.15,1.04和0.94mu;mol g-1，导致与空白相比，Cu含量增加分别为45.6, 40.4, 28.4和16.0％。

Cu与乙酸/草酸盐，酸/柠檬酸/ EDTA之间的摩尔比为5，，蚯蚓中Cu水平降低，其中Cu含量为1.10,1.08,0.98和0.83mu;molg-1，与空白对照相比Cu分别增加了35.8, 33.3, 20.9和2.0％。铜含量在用EDTA和Cu处理的蚯蚓中与空白对照值0.81mu;molg-1没有显著差别（图1a）。这些结果表明，OAs可能会减少重金属铜在蚯蚓中的富集。另外，我们Pears

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[26852]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word