论文总字数：30807字

摘 要

生物膜（biofilm）是自然界中微生物群落的一种形态。微生物像蜂群一样聚集在一起，会分泌有机物，形成一层膜状物质。微生物通过形成这种群落结构能够更好的适应外界环境，抵抗不利于生存的因素。在工业发酵应用领域，生物膜形成的机理研究还为之尚少，对于生物膜固定化发酵带来的发酵速率的提高以及对产物抑制的耐受性提高的机理研究依然不清楚。因此在我们的研究中，我们选取酿酒酵母工业生产菌株作为研究对象，酿酒酵母菌是乙醇生产中运用最普遍的发酵微生物，细胞的固定化发酵相较于游离发酵在发酵稳定性和发酵速率等方面有着极高优势。本文主要从细胞周期的角度探究生物膜形成机理。

1. 为了解析固定化发酵优势背后的秘密，我们将目光放在控制细胞周期的进度的基因SWI5上。SWI5是推动细胞G2/M进程的基因，是细胞分裂不可或缺的关键转录调控因子。

2. 为了对选定基因进行进一步的剖析，我们利用分子生物学手段构建了目的基因的工程菌，我们利用长同源臂重组敲除（LFH-PCR）技术，构建了基因敲除菌株SWI5/SWI5△。同时我们在原始酿酒酵母菌株1308中过表达SWI5基因，构建了菌株pSWI5。在表型分析实验中，SWI5基因敲除菌展现出了生物膜形成能力增强的情况，这些观测结果进一步证明了SWI5与生物膜的形成之间存在重要关系。

关键词：酵母细胞 成膜机制 基因重组

Effect of Swi5 on Cell Membrane Formation of Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Biofilm is a form of microbial community in nature. Microorganisms gather like bees and secrete organic matter to form a membrane. By forming this community structure, microorganisms can better adapt to the external environment and resist unfavorable factors for survival. In the field of industrial fermentation application, the mechanism of biofilm formation is still scarce, and the mechanism of the increase of fermentation rate and the tolerance to product inhibition caused by immobilized biofilm fermentation is still unclear. Therefore, in our research, we selected industrial strains of Saccharomyces cerevisiae as the research object. Saccharomyces cerevisiae is the most commonly used fermentation microorganism in ethanol production. Compared with free fermentation, immobilized fermentation of cells has great advantages in fermentation stability and fermentation rate. By means of histology and molecular biology, the causes of biofilm formation in immobilized fermentation of Saccharomyces cerevisiae cells were explored at the molecular level.

1. Through the transcriptome analysis of Saccharomyces cerevisiae genome, we obtained the whole gene expression of cells at different stages of biofilm formation. To further elucidate the secrets behind the advantages of immobilized fermentation, we focused on the gene SWI5, which controls the progress of cell cycle. Among these genes, we focused on a class of genes called SWI5. These genes are expressed in several different ways in the process of biofilm formation.

1. In order to further analyze the selected genes, we constructed the engineering strain of the target gene by means of molecular biology. We constructed the gene knockout strain SWI5/SWI5 Delta by using long homologous arm recombination knockout (LFH-PCR). At the same time, we overexpressed the SWI5 gene in the original strain 1308 and constructed the strain pSWI5. In phenotypic analysis experiments, SWI5 gene knockout bacteria showed enhanced biofilm formation ability. These findings confirm the significant relationship between biofilm formation and swi5.

Keywords: Saccharomyces cerevisiae biofilm forming mechanism

gene recombination

目 录

摘要…………………………………………………………………………………I

ABSTRACT………………………………………………………………………II

第一章 文献综述…………………………………………………………………7

1.1 生物被膜……………………………………………………………………7

1.1.1 生物被膜概述………………………………………………………7

1.1.2 生物膜的形成过程…………………………………………………7

1.1.3 生物膜结构、组成…………………………………………………9

1.2 生物膜的耐药性与工业应用………………………………………………9

1.2.1 医学领域的耐药性…………………………………………………9

1.2.2 生物膜反应器……………………………………………………10

1.3 生物膜的调控机制………………………………………………………11

1.3.1 各种有关生物膜调控的假说……………………………………11

1.3.2 Flo基因家族………………………………………………………14

1.3.3 信号调控路径……………………………………………………15

1.3.4 细胞周期…………………………………………………………15

1.4 研究目的和意义…………………………………………………………18

第二章 基因工程菌株的构建…………………………………………………18

2.1前言………………………………………………………………………18

2.2 材料与方法………………………………………………………………18

2.2.1 试剂与仪器…………………………………………………………18

2.2.2 目的基因敲除………………………………………………………21

2.2.3目的基因过表达……………………………………………………26

2.3 结果与分析…………………………………………………………………28

2.3.1 SWI5敲除菌株构建………………………………………………28

2.3.2 SWI5原始菌株中过表达…………………………………………30

2.4 本章小结……………………………………………………………………33

第三章 成膜相关基因对生物膜的影响……………………………………34

3.1前言………………………………………………………………………34

3.2 材料与方法………………………………………………………………34

3.2.1试剂与仪器………………………………………………………34

3.2.2 菌株侵入生长能力测试……………………………………………34

3.2.3菌株96孔版实验…………………………………………………34

3.3 结果与分析……………………………………………………………35

3.3.1 菌株侵入生长能力分析……………………………………………35

3.3.2 96孔板实验…………………………………………………………36

3.4 本章小结………………………………………………………………37

第四章 结论与研究展望………………………………………………………38

4.1结论………………………………………………………………………38

4.2 研究展望…………………………………………………………………38

参考文献…………………………………………………………………………40

致谢………………………………………………………………………………44

第一章 文献综述

1.1 生物被膜

1.1.1 生物被膜概述

生物膜，另一种名词解释也可称为生物被膜，通常可存在于微生物及其细胞的形式的生物或非生物介质表面上，一般以致密，复杂的生物聚集体的形式存在，由细胞外聚合物（EPS）构成[1]。在地球上，生物膜是最常见的微生物存在形式之一，90％以上的细菌以生物膜的模式存在[2]，生物膜与80％以上的细菌感染有关。同时，在我们的日常生活中生物膜痕迹随处可见，例如树木覆盖的斑块，石器表面和周围岩石样品中的微生物群落，牙釉质表面上的牙菌斑生物膜等。早在1683年，有一位著名的荷兰显微镜学家Antony van Leeuwenhoek在给皇家学会的一封信中写到，他通过自制显微镜观察和描述斑块中的微生物。该显微镜是最早与细菌生物相关的仪器，这是有关细菌生物膜的最早的膜科学研究[3]。从那时起，生物膜研讨一直很缓慢，直到1978年Costerton等人第一次提到相关的生物膜理论[4]，在20世纪70年代后期，生物膜作为独立学科迅速开展。1990年，蒙大拿州立大学创立了世界上第一个生物膜工程试验中心。 1991年John R. Lawrence和加拿大国家水环境研究所的其他人首先描述了细菌生物膜的三维性和三维结构[5]。此外，生物膜在工业生产中表现出优异的性能，极大地提高了生产效率，正因为这些成就使得生物膜的研究越来越受到国内外研究者关注。

1.1.2 生物膜的形成过程

生物膜的形成是一个动态的时空生长过程。依据不同生长阶段生物膜的外观表型和内部细胞外观，生物膜的成长进程一般分为五个发育期：

1）初始粘合期。自由单细胞微生物刚刚附着在培养基表面的时期，微生物与培养基表面之间的力弱，细胞之间缺乏紧密粘附，细胞虽然固定在细胞上。但介质表面不强。此阶段的固定细胞可以再次返回到单细胞的自由状态。

2）对数生长固定期。固定的细胞继续繁殖并生长，并开始分泌大量的细胞外基质。 微生物细胞通过细胞外基质粘附在一起并牢固地粘附在培养基表面上。在此阶段，生物膜内的细胞基本上不能恢复到原始的单细胞状态。固体表面上的生物膜以点状方式分布。

图 1-1生物膜的形成发展过程

3）成熟稳定期。在生物膜发育的高峰期，微生物形成具有三维结构的微菌落。因为所处的外部环境有差别，故而生物膜表现出多种菌落形态。典型的结构是蘑菇形，扁平形或流线型。该阶段的生物膜具有最稳定的生理结构和最强的环境抵抗力。

4）扩散和解体期。成熟的破裂生物膜由于外部环境的变化（例如营养，温度和pH）而表现出“破裂”现象。在这个阶段，生物膜形态变化有两种解释：①生物膜的活跃破裂，用于生命的再生，以及生物膜内单细胞的释放，以在不同的位置启动新的生物膜。复制和通过的现象；②生物膜受到生活环境恶化的迫使，被动组织结构是衰退的标志。

1.1.3 生物膜结构、组成

由不同的微生物细胞形成的生物膜具有不同的结构组成，即使相同的微生物在不同的生长阶段和环境条件下形成的生物膜也不尽相同。自然界中的许多生物膜由多种微生物组成，这不仅增加了生物膜的多样性，而且直接导致生物膜的结构和组成的复杂性。在实验室环境中，为了方便研究，研究人员培养了单一种类的微生物，而后对其形成的生物膜进行分析。结果发现，生物膜是以城市形式存在的，十分复杂和高度有组织的微生物的聚集体。在微生物细胞与人类一样的情况下，细胞外多糖会像城市建筑一样聚集“骨架”。物流运输水道就像城市道路管道。人类复杂的互联网系统就像生物膜的表面和内部的系统。信号传感和传导系统可以看出，有必要了解生物膜的复杂结构组成，以更好地了解生物膜的生理生化特征和生存机制。成熟的生物膜是一种具有多相组成的粘性复合物，其90％以上的成分是水和细菌细胞[6]。胞外多糖，蛋白质组学，脂质和DNA以及几种小分子酶也是生物膜中常见的组分，来自细胞的活跃分泌或破裂的死细胞的被动释放。此外，生物膜周围环境中的各种小分子物质和有机和无机物质也被包封在生物膜基质中。添加这些组分不仅增加了各种生物膜组分，而且还赋予生物膜各种生物形式。

1.2 生物膜的耐药性与工业应用

1.2.1 医学领域的耐药性

生物膜细胞比游离细胞具有更强的抗性，现在被认为是两者之间最明显的差异。临床经验发现，当药物能有效杀灭实验室环境中的细菌微生物时，很难完全消除病原菌。通过大量此类病例，人们发现细菌对体内的抵抗力的药物特性不仅与细胞本身的耐药性增加有关，而且与细胞形成的生物膜有关。当细菌形成生物膜时，它们的抗性通常比单细胞状态强10-1000倍[8]，因而生物膜形成是细菌抗性形成的重要机制之一。随着现代医学高科技的发展，越来越多的植入医疗材料（气管导管，静脉导管，导管等）已成为体内某些细菌生长的“温床”。一旦这些病原体在这种生物医学材料的表面上形成生物膜通常难以完全去除，同时，随着疾病的反复发作，植入物必须再次更换，从而导致患者巨大的疼痛和经济负担。因此，钻研致病性感染生物膜对预防临床感染具备重要意义。通过对生物膜结构，组成和基因水平的研究，提出了关于细菌生物膜抗性的各种机制和假设，如屏障保护;营养限制理论;抗性基因的表达;主动防御机制和群体反应防御机制。这些机制和假设加速了对细菌生物膜抗性的理解，为慢性复发性感染的医治提供了理论依据。

1.2.2 生物膜反应器

图 1-1生物膜反应器 ^[9]

请支付后下载全文，论文总字数：30807字