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摘 要

ε-聚赖氨酸是一种由微生物生产的氨基酸同型聚合物，它由L-赖氨酸的ε-氨基与另一L-赖氨酸的α-羧基形成的ε-酰胺键连接而成。ε-PL的合成与菌体生长是半偶联在一起的，其生长期和稳定期所需要的C/N是不同的。通过对摇瓶两阶段发酵探究C/N对ε-PL的影响，发现随着C/N的升高，ε-PL产量表现出先高后低的趋势。ε-PL合成的过程中最合适的C/N为4.71，NH₄ -N浓度为1 g/L。在5 L发酵罐发酵结束后发现，S. albulus PD-1在最佳C/N下发酵菌体生长和产物合成上均表现出较高的优势，生物量和ε-PL产量分别达到32.3 g/L和30.7 g/L，和原始工艺相比分别提高了15.8%和53.5%。比生长速率和产物比合成速率都有比较明显的提高，说明合适的C/N对ε-PL的合成起促进作用，菌体的生长也有一定程度的提高。通过基因转录水平的测定表明优化后的C/N可以促进S. albulus PD-1中相关基因的转录水平提高，致使一系列反应的发生，包括ε-PL合成相关酶活和氮代谢相关基因的变化，但对糖代谢途径影响较小。

关键词：聚赖氨酸 C/N 发酵工艺 S. albulus PD-1

ABSTRACT

Comprised of L-lysine residues linked by bonds between α-carboxyl and ε-amino groups, epsilon-poly-lysine (ε-PL) is a homo-poly-amino acid produced by microbiology. Due to its good properties including antimicrobial activity, biodegradability, edibility, and non-toxicity toward humans and the environment, it was used as a food preservative in Japan, USA, and other countries.Synthesis and cell growth ε-PL is a semi-coupled together, the growth and stability of the required C/N is different. Through the two-stage fermentation flask inquiry of C/N of ε-PL found with C/N is increased, ε-PL yield exhibited first high to low trend. ε-PL synthesis optimum C/N was 4.71, NH4 -N concentration of 1 g/L. After the end of the 5 L fermentor found, S. Albulus PD-1 bacterial fermentation in the best C/N and grown on a synthetic product showed higher strengths, biomass and ε-PL yield reached 32.3 g/L and 30.7 g/L, respectively, compared to the original process improved 15.8% and 53.5%. The specific growth rate than the rate of synthesis and the product has a more significant increase, indicating the appropriate C/N from the synthesis of ε-PL role in promoting cell growth have improved to some extent. By measuring the level of gene transcription indicates that the optimized C/N can contribute to improve the level of transcription S. albulus PD-1 related genes, resulting in a series of reactions, including the synthesis of ε-PL related activity and nitrogen metabolism-related genes changes, but on glucose metabolism pathway was less affected.

Key words: ε-Poly-L-lysine; C/N; fermentation process; S. albulus PD-1

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 前言 1

1.2 ε-PL简介 1

1.2.1 ε-PL的结构与性质 1

1.2.2 ε-PL的生产菌株的筛选 2

1.2.3 ε-PL生产工艺的研究 2

1.2.4 ε-PL的应用 4

1.3 碳氮比对菌体生长的影响 5

第二章 C/N对发酵生产ε-PL的影响 6

2.1 前言 6

2.2 实验材料 6

2.2.1 菌种 6

S. alublus PD-1（CCTCC M2011043），本实验室筛选保存。 6

2.2.2实验仪器及试剂 6

2.3 实验方法 7

2.3.1 种子液的制备 7

2.3.2 摇瓶发酵 7

2.3.3 发酵罐发酵 7

2.3.4 ε-PL含量检测 8

2.3.5 菌体干质量测定 8

2.3.6 残糖测定方法 8

2.3.7铵态氮（NH₄ -N）测定方法的建立 8

2.3.8 pH 测定 8

2.4 结果与分析 9

2.4.1 C/N对摇瓶两阶段发酵生产ε-PL的影响 9

2.4.2 最优C/N下的发酵过程曲线比较 9

2.4.3 分批发酵动力学分析 11

2.5 讨论 13

第三章 C/N的优化对ε-PL关键基因的影响 14

3.1 前言 14

3.2 材料与方法 14

3.2.1 主要实验仪器与试剂 14

3.2.2 酶活测定 14

3.2.3 qRT-PCR分析 15

3.3 结果与分析 17

3.3.1 氮代谢途径中相关酶基因 18

3.3.2 碳代谢途径中相关酶基因 19

3.3.3 ε-PL合成途径中相关酶基因 20

3.4 讨论 21

第四章 结论与展望 22

4.1 结论 22

4.2 展望 22

参考文献 24

致 谢 27

1. 文献综述

1.1 前言

ε-聚赖氨酸（ε-poly-L-lysine，简称ε-PL）是日本的酒井平一和岛昭二两位博士1977年在大量筛选有价值的生物碱（Dragendorff-positive）物质时首次发现的一种新型聚合物。ε-PL是现在自然界仅发现的四种氨基酸同聚物之一，其具有广谱抑菌性，能够抑制革兰氏阳性菌、真菌和病毒的活性，是一种性能优良的生物防腐剂^[1]。同时鉴于其聚阳离子性，水溶性好，热稳定性好，生物可降解等显著特点，ε-PL及其衍生物具有广阔的应用前景^[2,3]。

研究表明，微生物源防腐剂不仅对人体安全无毒，还具有一定的营养价值，大力开发安全无毒、高效、经济的生物防腐剂，已成为食品保鲜的必然发展方向之一。世界各国经常使用的微生物源防腐剂主要有乳酸链球菌素（Nisin）、ε-聚赖氨酸（ε-PL）等^[4,5]。

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