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摘 要

ε-聚赖氨酸（ε-PL）是原生态的食物添加剂，它由酰胺键联接L-赖氨酸的α-氨基和ε-羧基组合而成的多聚氨基酸，主要由放线菌发酵获得。为了在分子水平上更好地研究ε-PL生物合成的机制，构建ε-聚赖氨酸的高产菌株，本文建立了一株产ε-聚赖氨酸的白色链霉菌遗传转化体系。通过对培养基类型、孢子热激处理温度及时间、培养基中MgCl₂ 浓度等条件进行探索分析，以大肠杆菌作为供体菌成功地将pIB139质粒导入到S. albulus PD-1菌株中。经过传代实验和PCR验证，结果表明pIB139在S. albulus PD-1染色体的attB位点上能够稳定整合。本次研究建立了ε-聚赖氨酸的白色链霉菌的遗传转化体系，为ε-PL生产菌株在分子水平上的研究奠定了基础，也为ε-PL高产菌株规模化生产提供了可能性。

关键词：ε-聚赖氨酸 遗传转化体系 pIB139

A study of the genetic transformation system for Streptomyces albulus PD-1, a ε-poly-l-lysine-producing strain

Abstract

ε-Poly-l-lysine (ε-PL) is amide bond connecting α-carboxyl and ε-amino groups of l-lysine, is a kind of natural food additive, mainly by actinomyces fermentation. In order to better study at the molecular level ε-PL biosynthesis mechanism, construct the ε-Poly-l-lysine high-yield strains, this paper established a white Streptomyces strains produce ε-Poly-l-lysine genetic transformation system. By media type, spore heat shock treatment temperature and time, medium MgCl2 concentration and exploration on the conditions, with escherichia coli as the donor bacterium successfully pIB139 plasmid into s. albulus PD - 1 strain. After batches experiment and PCR test, the results show that pIB139 in s. albulus PD - 1 integrates attB site can be stable in chromosome. This study has established the ε-Poly-l-lysine white genetic transformation system of Streptomyces for ε-PL production strains at the molecular level research laid the foundation, also provides the ε-PL high-yield strains of large-scale production possibilities.

Key words: ε-Poly-l-lysine;Genetic transformation system; pIB139

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1 研究背景 1

1.2 国内外研究综述 1

1.2.1 ε-聚赖氨酸 1

1.2.3 遗传转化体系及结合转移 3

1.3 研究意义、目的、目标 4

1.3.1 研究意义 4

1.3.2 研究目的 5

1.3.3 研究目标 5

1.4 研究的主要内容，研究方法 5

1.4.1 研究的主要内容 5

1.4.2 研究方法 5

第二章 实验材料与方法 7

2.1 实验材料 7

2.1.1 菌株，质粒 7

2.1.3培养基 8

2.2 实验方法 8

2.2.1 S. albulus PD-1菌株对抗生素的敏感性测试 8

2.2.2 接合转移 8

2.2.3 根据S. albulus PD-1接合转移效率选择培养基 9

2.2.4孢子热激处理 9

2.2.5 测试pIB139质粒在S. albulus PD-1菌株中的稳定性 9

第三章 结果与讨论 10

3.1 S. albulus PD-1菌株对抗生素的抗性测试 10

3.2 S. albulus PD-1接合转移培养基类型 10

3.3 S. albulus PD-1孢子热激处理对接合转移效率的影响 11

3.4 其它处理条件对S. albulus PD-1接合转移效率的影响 12

3.5 pIB139质粒在受体菌株中的稳定性 12

第四章 结论与展望 14

参考文献 15

致谢 17

第一章 绪论

1.1 研究背景

ε-聚赖氨酸是由酰胺键联接L-赖氨酸的α-氨基和ε-羧基组合而成的多聚氨基酸，其构造独特，在食品和生物领域已经被广泛应用。值得一提的是，因为ε-聚赖氨酸抑菌效果良好且安全性较高，作为一种天然的防腐剂，多个国家已经批准其可以被添加在食品以及化妆品中。2014年，我国同意食品领域能够采用ε-聚赖氨酸。迄今为止，取得ε-聚赖氨酸主要途径是是放线菌发酵。第一株ε-聚赖氨酸菌株在1977年被筛选出来，微生物合成ε-PL的方法被研究的较多，研究者们通过尝试各种措施来提高其合成效率，但是很少有人彻底的研究过ε-PL的合成机制。原因大多是ε-PL菌株的遗传转化体系难以构建。对菌株进行代谢途径改造、基因鉴定分析等遗传操作都需要遗传转化体系的辅助。国内外的研究状况是 Hamano等建立了适用于S. albulus IFO14147的接合转移体系，该体系基于由它的内源质粒复制子构建的复制型质粒，并利用此遗传体系探索了ε-PL的合成机制。但这项研究针对于S. albulus IFO14147内源质粒复制子，其它ε-PL产生菌株并不能利用。尽管ε-PL产生菌株遗传转化体系构建的重要性越来越被众多研究者们意识到，但是因为其具有的放线菌丝状菌体形态、细胞壁较厚，生长周期较长等特点，关于ε-PL生产菌株遗传转化体系建立或者其分子改造的报道很少见到。

本研究中，我们以大肠杆菌作为供体菌成功地将pIB139质粒导入到S. albulus PD-1菌株中。经过传代实验和PCR验证，结果表明pIB139在S. albulus PD-1染色体的attB位点上能够稳定整合。本研究首次将常用质粒pIB139整合到ε-聚赖氨酸生产菌株体内并建立了ε-聚赖氨酸的白色链霉菌的遗传转化体系，相比于上述的研究方法，pIB139的具有如下优点：适用范围广、其它ε-PL生产菌株也可以利用等优点。所以，在本研究中建立的ε-聚赖氨酸的白色链霉菌的遗传转化体系对于国内研究其合成机制有很好的借鉴意义也为ε-PL的高产菌株的产生提供一些希望和可能性。

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