摘 要

从海南杆菌 NK-02 中克隆了一种新的-卡拉胶酶基因（CgkB），并在大肠杆菌 BL21（DE3）中异源表达。 它由 1935bp 组成，编码644个氨基酸残基，分子量为71.61kDa。重组酶分别在40℃和 pH8.0 下显示最大活性为 2458U mg-1。此外，在低于 40℃的 pH 5〜5 0 下培养后，其可保持超过 70％的最大活性。K 和广泛浓度的 NaCl 可以激活酶活力。 CgkB 的 K_m 和 V_max 分别为 2.4 mg/mL和 126 mg/mL/min。水解产物的 ESI-MS 分析表明该酶可以将卡拉聚糖内切解聚成四糖和六糖。 结果表明，具有高活性的酶可能是产生具有各种活性的卡拉胶低聚糖的有价值的酶工具。

关键词：卡拉胶酶 表征 克隆 表达 低聚糖

High-level expression and characterization of a new -carrageenase from marine bacterium Pedobacter hainanensis NK-02

ABSTRACT

A novel K-carrageenase gene (CgkB) has been cloned from Pedobacter hainanensis NK-02 and expressed heterologously in Escherichia coli BL21 (DE3). It consisted of 1935 bp and encoded 644 amino acid residues with a molecular weight of 71 61 kDa. The recombinant enzyme showed maximal activity of 2458 U mg 1 at 40°C and pH 8 0. Additionally, it could retain more than 70% of its maximal activity after being incubated at pH of 5. 5–10. 0 below 40 °C. K and a broad range of NaCl can activate the enzyme. The Km and Vmax of CgkB was 2.4 mg/mL and 126 mmol/ mg/ min. The ESI-MS analysis of hydrolysates indicated that the enzyme can endolytically depolymerize the carrageenan into tetrasaccharides and hexasaccharides. The results indicated that the enzyme with high activity could be a valuable enzyme tool to produce carrageenan oligosaccharides with various activities.

Keywords ：Carrageenase; Characterization; Cloning; Expression; Oligosaccharides

目录

第一章 前言 1

1.1 卡拉胶酶简介 1

1.1.1 卡拉胶简介 1

1.1.2 卡拉胶酶概述 2

1.1.3 卡拉胶酶的研究进展 2

1.1.4 卡拉胶酶的来源及分类 3

1.2 K-卡拉胶酶的分离纯化 3

1.3 K-卡拉胶酶的酶学性质的研究 3

1.3.1 K-卡拉胶酶的底物特异性 3

1.3.2 温度对K-卡拉胶酶酶活的影响 3

1.3.3 PH 对K-卡拉胶酶酶活的影响 4

1.4 本课题的研究内容及意义 4

1.4.1研究内容 4

1.4.2 研究意义 4

第二章 实验材料与方法 5

2.1实验材料 5

2.2实验方法 5

2.2.1 K-卡拉胶酶的克隆及序列分析 5

2.2.2 重组酶的异源表达及纯化 5

2.2.3 重组酶 CgkB 的生化特性 7

2.2.4 卡拉胶的酶解及降解产物的 ESI-MS 分析 7

第三章 结果与讨论 8

3.1 卡拉胶酶基因CgkB 的克隆和序列分析 8

3.2 重组CgkB 的异源表达纯化 9

3.3 重组酶的生物化学表征 10

3.4 卡拉胶酶解及酶降解产物的 ESI-MS 分析 11

第四章 结论与展望 13

4.1 结论 13

4.2 展望 13

参考文献 14

致 谢 18

第一章 前言

1.1 卡拉胶酶简介

1.1.1 卡拉胶简介

卡拉胶是从海藻的一些种类中提取的线性硫酸化半乳聚糖。卡拉胶具有交替的1,3-连接的D-吡喃半乳糖基和-1,4-连接的D-吡喃半乳糖基单元的共同骨架。根据硫酸盐取代物的数量和位置，以及存在3,6-脱水桥的情况，它们分为三种类型：κ（ - ），iota（ - ）和λ（ - ）， 1,4-连接的半乳糖残基。卡拉胶由于其优异的物理功能特性如增稠，胶凝和稳定能力而被广泛使用。然而，卡拉胶多糖的高分子量和较差的组织穿透能力大大限制了它们的进一步应用。与卡拉胶和卡拉胶相比，卡拉胶显示出更强的抗氧化活性，这引发了越来越多的研发潜在抗氧化剂的兴趣。

一般来讲，卡拉聚糖低聚糖（-COSs）是从卡拉胶降解得到的，定义为聚合度从1到5 。事实上，大多数研究已经证明聚合-COSs，即新卡拉果糖，新卡拉己糖，新卡拉藻糖和新卡拉糖1-4 exhibit展现出各种生物和生理活性，包括抗菌，抗肿瘤，抗氧化剂和抗血管生成。卡拉胶酶是酶解技术中产生Coss的重要酶，具有较高的底物特异性和温和的反应条件。 ASE(EC 3.2.1.83)属于糖苷侧水解酶(GH 16)16家族，它专门切割卡拉胶的内部(1-4)连接，产生一系列同源偶数寡聚体。虽然这类酶已从几种海洋细菌中纯化，但在UTI使本地卡拉胶酶液化方面仍存在一些问题：酶产量和活性低，培养系统复杂，以及 产品的混合物。异源表达可能是解决这些问题的关键。一些卡拉胶酶已经被克隆和表达，例如，从Zobellia sp.ZM-2， Pseudoteromonas sp.中的CgkX和CgkP.QY 203，来自Shewanella sp.KZ 7和cgkK142b。不同卡拉胶酶在一级结构、酶特性和生产力方面具有不同的性质。大部分重组卡拉胶酶水解的主要产物-卡拉胶 S(CgkX、CgkP和CgkS)的聚合程度较低(新Carratetraose和neo-carrabiose)。Zobellia sp.ZM-2CgkZ新卡拉胶和新碳水化合物.虽然我们以前的研究已经证明，天然卡拉胶酶从分解细胞噬菌体菌株n5-2可以水解。

卡拉胶首先分为新卡拉胶，然后将新卡拉胶分解为新卡拉胶糖。然而，重组卡拉胶酶产生新胡萝卜素未见报道。因此，新的卡拉胶酶的发现在工业生产中的应用和更高聚合度的卡拉胶酶的纯化很重要。