磁蛋白MagR的细菌表面展示研究开题报告
2020-04-22 07:04
1. 研究目的与意义（文献综述）
利用细菌表面展示技术，可以将特定的功能蛋白展示在细菌表面，将细菌微生物作为一个微反应器来辅助蛋白质发挥其作用。表面展示的功能蛋白具有高活性、易于操作等优点，在体外催化、全细胞吸附、重组细菌疫苗、抗原表位分析、环境修复等多个领域具有广泛的应用。
inp是一种膜蛋白,发现于欧氏杆菌、假单胞杆菌和黄单胞菌属。在过冷的水中,它能使宿主细胞形成冰晶核。inp由n端结构域、c端结构域及中央结构域组成。其中n端结构域负责锚定于细胞表面,中央结构域是由8、16、48个残基周期性组成的重复结构,是冰晶核形成的模板。已经有几种inp的呈现系统得到应用,如inp全长序列,只包括n和c末端的序列inp nc,inp nc加上内部重复单位以及n端(inp n)加上内部重复单位〔1〕。inp的优点包括:稳定的表达和外膜转运;内部重复单位长度可调整,可借以调节外源蛋白和膜表面之间的距离;通过冰晶核形成活性试验可检测异源蛋白是否表达在细胞表面;表达inp融合蛋白不影响膜的结构和宿主细胞生长;inp可在多种革兰氏阴性菌中表达,并可呈现大分子蛋白。
cry蛋白被普遍认为参与到了生物体的磁感应现象中。而谢灿的工作则证明了magr蛋白很可能也参与了磁感应现象的信号通路中。谢灿的团队证明了magr蛋白和cry蛋白可以在体外组成棒状复合物，并且可以在体内，即视网膜上共定位。这两种蛋白组成的复合物的晶体在体外会根据磁场的方向改变自己的朝向。并且，magr蛋白在一系列实验中表现出了内禀磁性，暗示了其在磁感应通路中可能起到一定的作用。谢灿课题组发现的磁感应蛋白magr，分子量只有14.5 kda，非常方便进行基因操作。据报道magr具有亚铁磁性，对一定强度的磁场具有响应性，或许可以成为非常理想的磁感应元件。张生家课题组通过体内生物学实验，结合磁受体isca1（magr）蛋白的遗传靶向和远程磁刺激实现神经元的非侵入性激活，通过启动子将 isca1（magr）基因特异性地导入秀丽隐杆线虫的肌肉细胞和机械敏感神经元中，外界磁场可以分别触发线虫肌肉的收缩和后退行为[26]。
2. 研究的基本内容与方案
研究基本内容：
1，通过分子生物学技术构建pET-28a[INP-MagR]细菌表面展示载体；
2，利用IPTG对磁蛋白基因进行诱导表达
3，检测磁蛋白的表面展示情况；
4，对细菌的性能及表面展示的磁蛋白的性能进行研究。
技术方案
1. 构建pET-28a[INP-MagR]重组质粒
1) pET-28a[MagR]质粒构建
所使用的的原始质粒为Pet-28a[MagR-Cry],设计正向引物为MagR BamH1 F1,反向引物为MagR BamH1 R1,进行PCR,通过正反向引物删除质粒中Cry片段，得到pET-28a[MagR]质粒。
按以下配方配制PCR反应体系：
表2-4 克隆PCR反应（25μl）体系
| 试剂 | 引物浓度1所取体积（μL） | 引物浓度2所取体积（μL） |
| H2O | 14.0 | 13.0 |
| 10×buffer | 2.5 | 2.5 |
| MgSO4 | 2.0 | 2.0 |
| dNTPs | 2.5 | 2.5 |
| MagR BamH1 F1 | 1.0 | 1.0 |
| MagR BamH1 R1 | 1.0 | 1.0 |
| KOD 酶 | 1.0 | 1.0 |
| Template | 1.0 | 2.0 |
Template是提取的质粒Pet-28a[MagR-Cry]（含有目的基因MagR）
PCR程序设置的反应条件如下：
第一阶段：95℃预变性5分钟；
第二阶段：95℃变性30秒，65℃复性30秒，72℃延伸15分钟，10个循环；
第三阶段：95℃变性30秒，55℃复性30秒，72℃延伸15分钟，10个循环；
第四阶段：72℃超长延伸10分钟。
PCR产物检测—琼脂糖凝胶电泳
使用琼脂糖浓度为0.8%的凝胶，在配置凝胶体系时加入染料溴化乙锭（EB，可以与DNA和RNA分子结合，使其在紫外线照射下显出荧光，从而便于观察和分离）。取PCR反应产物2mL，加入6×loadingbuffer混匀，点样后以60V稳压电泳40分钟，在紫外灯照射下观察有无目标条带，并用凝胶成像系统拍照。
2）扩增INP片段
所使用的的质粒片段为INP*6His,设计正向引物INP NcoI F1,反向引物INP BamH1 R1,进行PCR扩增，精确获得INP片段。
按照上述PCR反应体系进行配置。
3）连接INP片段和pET-28a[MagR]质粒，得到目的质粒pET-28a[INP-MagR].
4)将目的质粒导入大肠杆菌细胞BL21，获得所需目的菌株。
菌落PCR筛选方法：
从平板中挑取数个生长较好的单菌落，每个单菌落加10#181;l去离子水吹打均匀，分散的菌液取5#181;l加入到菌落PCR体系液中，其余的置于4℃保存。每管PCR反应液组分及含量如下表所示：
| 组分 | 体积（#181;l） |
| 菌液 | 5 |
| H2O | 2.35 |
| 10x buffer | 1 |
| MgCl2 (50 mM) | 0.8 |
| dNTP （10 mM） | 0.2 |
| F1/R1 引物 | 0.2/0.2 |
| DNA Polymerase | 0.25 |
根据目标片段长度，选择touch down PCR的程序。
菌落PCR完成后，通过DNA凝胶电泳观察DNA片段所处的位置，如果条带位置正确。将冰箱中保存的5#181;l菌液接种到含有AMP的液体LB培养基中，过夜培养，培养条件37 oC, 220 rpm/min。第二天从菌液中提取质粒，送去测序。
2. 重组蛋白诱导表达，纯化及检测
将重组质粒导入到宿主E. coli BL21的感受态细胞中后，将含阳性重组质粒的菌株接种到3mL含卡那霉素的LB液体培养基中，在设定为37℃、220rpm的摇床中培养过夜。12-15小时后按1:50的体积比接种到50mL LB液体培养基中。培养约2小时，直至其OD600达0.5附近。随后按照1#61549;g·mL-1 的浓度加入IPTG，诱导蛋白表达。继续在摇床中培养3个小时。培养结束后取200#61549;L菌液样品，做SDS-PAGE电泳。余下菌液做蛋白提取及纯化。
3. 对表达磁蛋白的细菌的性能研究
设置磁场和光照梯度，对细菌进行处理，测得不同条件下细菌的生长性能，并进行比较
4. 实验条件的优化和处理
通过对IPTG浓度和诱导时间的调整，以及磁场和光照处理的结果分析，来获得最佳的磁蛋白的表达条件。
目标：
1) 构建完整的pET-28a[INP-MagR]重组质粒，并且获得转化成功的含有目的质粒的大肠杆菌细胞。
2) 磁蛋白成功表达并被INP定位于细胞膜上
3) 对于磁场和光照条件，表达了磁蛋白的细菌会有响应。
4) 提取且纯化磁蛋白
3. 研究计划与安排
[1] 第1周：了解论文题目，认识所需完成的主要内容和任务；搜集相关学术期刊、论文、文稿、专利、教材等资料，阅读后进行总结，对论题形成一个初步的系统性的认识。
[2] 第2-3 周：完成毕业论文开题报告，确定实验技术路线，确定具体的实验方案和步骤。
[3] 第4-5周：通过分子生物学技术构建磁蛋白的细菌表面展示载体；表达和检测磁蛋白的表面展示情况。
4. 参考文献（12篇以上）
[1] huan wang,ping liu, hao xie*, an empirical molecular docking study of a di-iron bindingprotein with iron ions, journal of zhejiang university science c (computersamp; electronics), 2013, 14(2): 118-124 (sci).
[2] qin s, yinh, yang c, dou y, liu z, et al. a magnetic protein biocompass., naturalmaterials. 2016, 15(2):217-26.
